抗坏血酸/总抗坏血酸（AsA/T-AsA）含量检测试剂盒（比色法）说明书

可见分光光度法

货号：BC4630

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制： 

1、 试剂一：临用前加入3.3 mL 蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂-20℃分装避光保存。

2、 试剂六：临用前加入12 mL 70%乙醇（V/V）溶液溶解。

3、 标准品：临用前配制，加入1.136mL提取液充分溶解；吸取0.01 mL上述溶液，加入 0.99 mL提取液，混匀，即 500 nmol/mL AsA标准溶液。

产品说明:

抗坏血酸（AsA）是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，AsA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。脱氢抗坏血酸（DHA）是AsA的可逆的氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体作用。

AsA具有还原性，能将Fe³⁺还原成Fe²⁺，Fe²⁺与2,2’-联吡啶形成粉红色络合物，在525nm处有特征性吸收峰。DTT可还原DHA生成AsA，可用于检测样本总抗坏血酸（AsA+DHA）含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、可调式移液器、乙醇和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）: 提取液体积(mL)为 1: 5~10的比例（建议称取约 0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。

2. 细胞或细菌：按照细胞数量（10⁴个）: 提取液体积（mL）为 500~1000 ：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300 W，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3 min）；13000g，4℃离心10 min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：取500 μL样本，加入500 μL提取液，漩涡混匀。13000g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

二、 测定步骤

1.  分光光度计预热 30 min，调节波长到 525 nm，蒸馏水调零。

2.  AsA含量测定

AsA含量测定操作表，按照操作表加入下列试剂：

注意：加入试剂七时将枪头伸入液面以下加入，不可悬空滴加，否则会导致液体浑浊。空白管1、空白管2及标准管只需测定1-2次。

3.   T-AsA含量测定

T-AsA含量测定操作表，按照操作表加入下列试剂：

注意：加入试剂七时将枪头伸入液面以下加入，不可悬空滴加，否则会导致液体浑浊。空白管1、空白管2及标准管只需测定1-2次。

三、 AsA /T-AsA含量计算公式

a、AsA含量计算

（1）按样本质量计算

AsA(nmol/g 质量) =(C标准液×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管×V样)÷(W×V样÷V样总)

=500×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管÷W

（2）按细胞数量计算

AsA(nmol/10⁴ cell) =(C标准液×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管×V样)÷(细胞数量×V样÷V样总)

=500×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管÷细胞数量

（3）按液体体积计算

AsA (nmol/mL) =C标准液×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管×2=1000×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管

C标准液：标准品的浓度，500 nmol/mL；V样总：提取离心后上清液体积，1.0 mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.05 mL；W：样本质量，g；2：稀释倍数，（500μL液体+500μL提取液）÷500μL液体=2。

b、T-AsA含量计算

（1）按样本质量计算

T-AsA(nmol/g 质量) =(C标准液×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管×V样)÷(W×V样÷V样总)

=500×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管÷W

（2）按细胞数量计算

T-AsA(nmol/10⁴ cell) =(C标准液×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管×V样)÷(细胞数量×V样÷V样总)

=500×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管÷细胞数量

（3）按液体体积计算

T-AsA (nmol/mL) =C标准液×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管×2=1000×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管

C 标准液：标准品的浓度，500 nmol/mL；V 样总：提取离心后上清液体积，1.0 mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.05 mL；W：样本质量，g；2：稀释倍数，（500μL液体+500μL提取液）÷500μL液体=2。

c、DHA含量计算

DHA含量=T-AsA含量-AsA含量

（1）按样本质量计算

DHA (nmol/g 质量) = 500×（ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管-ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管）÷W

（2）按细胞数量计算

DHA (nmol/10⁴ cell) =500×（ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管-ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管）÷ 细胞数量

（3）按液体体积计算

DHA (nmol/mL) =1000×（ΔA₂ 测定管÷ΔA₂标准管-ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管）

注意事项：

1. 加入试剂七时将枪头伸入液面以下加入，不可悬空滴加，否则会导致液体浑浊。

2. 空白管1、空白管2及标准管只需测定1-2次。

3. A大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，并在计算时乘以相应的稀释倍数。

4. 本试剂盒可单独用于检测样本中AsA或T-AsA含量，也可在同时检测AsA与T-AsA含量后计算DHA含量。

5. 样本提取后当天检测。

实验实例：

1、取0.1g冬枣进行样本处理，按照测定步骤操作，测得计算ΔA₁测定管=（A测定管-A对照管）-(A空白管1-A空白管2）=（0.44-0.019）-（0.025-0.009）=0.402、ΔA₁标准管=A标准管-A空白管1=0.341-0.024=0.317，ΔA₂测定管=（A测定管-A对照管）-(A空白管1-A空白管2）=（0.591-0.020）-（0.024-0.008）=0.555、ΔA₂标准管=A标准管-A空白管1=0.375-0.024=0.351，按照样本质量分别计算AsA含量及T-AsA含量得：

AsA(nmol/g 质量)=500×ΔA₁测定管÷ΔA₁标准管÷W=6340.7 nmol/g 质量

T-AsA(nmol/g 质量) =500×ΔA₂测定管÷ΔA₂标准管÷W=7905.9 nmol/g 质量。

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