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果胶裂解酶（PL）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号: BC2640
规格: 50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂一 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
工作液：将试剂一倒入试剂二于50℃水浴中溶解（期间可拿出振荡数次）。该试剂易长菌，配制完成后可-20℃分装保存，可保存12周。
产品说明：
果胶裂解酶（EC4.2.2.10）是果胶酶的重要组成部分，催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛，主要来源于微生物，在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义，在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键，生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸，在235nm处有特征吸收峰，测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、恒温水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细胞、细菌或真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。（细菌、真菌等难以数量计算的微生物也可以称取0.1g 细菌/真菌沉淀来进行前处理）
培养液：直接测定。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至235nm，蒸馏水调零。
操作表：(在1.5mL离心管中)
| 试剂名称 | 测定管 | 空白管 |
| 工作液（μL） | 900 | 900 |
| 样本（μL） | 100 | - |
| 蒸馏水（μL） | - | 100 |
| 充分混匀同时按下计时器，测定10s时235nm下的初始值A1，40℃反应30min后再次测定吸光值A2，计算ΔA测定管=A2测定管-A1测定管，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。空白管只需做1-2次。 | ||
三、果胶裂解酶活性计算
按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×Cpr）÷T=64.1×ΔA÷Cpr
按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每克组织每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×W÷V样总）÷T= 64.1×ΔA÷W
按照细菌、真菌货细胞数量计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每104个细胞每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷（V样×N÷V样总）÷T= 64.1×ΔA÷N
按照培养液体积计算
酶活性定义：在40℃，pH5.5条件下，每毫升培养液每分钟分解果胶产生1nmol不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷V样÷T= 64.1×ΔA
ε：不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数，5200 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.001L；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min；109：换算系数，1mol=109nmol；N：细胞数量，以万计。
注意事项：
若A1测定管大于1.5或者ΔA大于0.5，将样本粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。
建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
空白管正常情况下变化不超过0.02。
实验实例：
取0.1g香蕉皮加入1mL提取液进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管= A2测定管-A1测定管=0.43-0.421=0.009，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0.217-0.217=0，按样本质量计算酶活得：
PL活性（U/g 质量）= 64.1×ΔA÷W=5.526 U/g 质量。
取0.1g大肠杆菌沉淀加入1mL提取液冰浴超声波破碎细胞，然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A2测定管-A1测定管=1.352-0.923=0.429，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0.217-0.217=0，按照样本质量计算酶活得：
PL活性（U/g 质量）= 64.1×ΔA÷W=274.99 U/g 质量。
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