羟*氨酸（HYP）含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC0250
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：自备6 mol/L盐酸溶液，大约需要100mL，常温保存；试剂盒内提供一个30mL棕色空瓶，仅做分装使用，请自行标注试剂名称

2. 6 mol/L盐酸提取液的配制：按浓盐酸（37%）和H₂O的体积比是1：1进行配制。

3. 标准品：0.5 mg/mL羟*氨酸标准品。

产品说明：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
样本经酸水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲***甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样本水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
技术指标：
检出限：0.051 μg/mL
线性范围：0.117-15 μg/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

“具体操作步骤详见“产品资料”附件”
注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用蒸馏水稀释样本后再进行测定。

2. 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。

3. 按样本蛋白浓度计算时，需单独提取样本中的蛋白质并测定。

实验实例：
取0.2g小鼠皮肤进行样本处理，取上清后蒸馏水稀释32倍后按测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.548-0.124=0.424，带入标准曲线y=0.0634x+0.0044，R²=0.9996，计算x=6.62，按样本质量计算含量得：
组织羟*氨酸含量（µg/g 质量）=4x÷W×32（稀释倍数）=4×6.62÷0.2×32=4236.8 µg/g 质量。
取8×10⁶个HMC-1细胞进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.245-0.124=0.121，带入标准曲线y=0.0634x+0.0044，R²=0.9996，计算x=1.84，按细胞数量计算含量得：
细胞羟*氨酸含量（µg/10⁶ cell）=2x÷N=2×1.84÷8=0.46 µg/10⁶ cell。
取300μL牛血清进行样本处理，取上清后按测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定管-A空白管=0.243-0.124=0.119，带入标准曲线y=0.0634x+0.0044，R²=0.9996，计算x=1.81，按液体体积计算含量得：
液体羟*氨酸含量（µg/mL）=6.67×x=6.67×1.81=12.07 µg/mL。
相关发表文献：

1. Litong Fan,Jiaqing Chen,Yanmeng Tao,et al. Enhancement of the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and cartilage repair by ghrelin. Journal of Orthopaedic Research. January 2019;(IF3.043).

2. Qu P, Rom O, Li K, Jia L, Gao X, Liu Z, Ding S, Zhao M, Wang H, Chen S, Xiong X, Zhao Y, Xue C, Zhao Y, Chu C, Wen B, Finney AC, Zheng Z, Cao W, Zhao J, Bai L, Zhao S, Sun D, Zeng R, Lin J, Liu W, Zheng L, Zhang J, Liu E, Chen YE. DT-109 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in nonhuman primates. Cell Metab. 2023 May 2;35(5):742-757.e10. doi: 10.1016/j.cmet.2023.03.013. Epub 2023 Apr 10. PMID: 37040763.

3. Hao Y, Zhou J, Tan J, Xiang F, Qin Z, Yao J, Li G, Yang M, Zeng L, Zeng W, Zhu C. Preclinical evaluation of the safety and effectiveness of a new bioartificial cornea. Bioact Mater. 2023 Aug 8;29:265-278. doi: 10.1016/j.bioactmat.2023.07.005. PMID: 37600931; PMCID: PMC10432718.

参考文献：

1. Naeini A, Miri R, Shafiei N. et al. Effects of topical application of Calendula officinalis gel on collagen and hydroxyproline content of skin in rats[J]. Comparative Clinical Pathology, 2012, 21: 253-257.

2. Ignat’eva N, Danilov N, Averkiev S. et al. Determination of hydroxyproline in tissues and the evaluation of the collagen content of the tissues[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2007, 62: 51-57.

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