非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒（免提法）

试剂盒应用

本试剂盒主要用于动物组织及血液中非洲猪瘟病毒DNA的扩增。将组织液（包括组织研磨液、细胞悬液、血液、血清、精液、唾液、尿液等）、组织块以及环境和拭子等样本进行处理后，可直接用于扩增。本试剂盒中使用的Rapid DNA-Lysis采用du特配方，能够快速高效的裂解各种常见样本，无需反复离心，从而获得高质量的DNA。试剂中引入了dUTP/UDG防污染系统，可消除扩增污染对qPCR的影响。

本试剂盒仅供研究使用，不可用于食品、化妆品等领域。

试剂盒组成

 保存条件

-20ºC保存。

使用前将Rapid DNA-Lysis室温充分混匀；荧光PCR反应液、阳性对照溶解后需置于冰上。

需要准备

荧光定量PCR仪、恒温金属浴、离心机、移液器

使用方法

一、不同样品的处理方法

1. 组织液的处理

（1）组织液包括组织研磨液、细胞悬液、血清、血液、唾液、尿液、精液等。取10 μL组织液置于离心管中。

（2）加入20 μLRapid DNA-Lysis。

（3）混匀。

（4）置于55℃作用5分钟，加入100μL样品稀释液，混匀后，取上清。

2. 组织块的处理

（1）用眼科剪取半颗米粒大小的组织块（< 3 mm³），并将组织块剪成肉泥状。

（2）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。

（3）混匀。

（4）置于55℃作用5分钟，加入100μL样品稀释液，混匀。

（5）8000转离心30秒取上清。

3. 环境样本和拭子的处理

（1）用棉签反复涂抹桌面、鞋底、头发、车轮等表面，并将棉棒浸泡在500ul（生理盐水、PBS或水）中，作用5分钟，将棉签中液体挤压至EP管中。

（2）吸取10 μL(1)中液体，加入20 μLRapid  DNA-Lysis。

（3）混匀。

（4）置于55℃作用5分钟。加入100μL样品稀释液，混匀取上清。

4.  提取对照的处理

（1）在上述1,2,3样品处理的同时，取10 μL（生理盐水、PBS或水）加入20 μL Rapid DNA-Lysis。

（2）混匀。

（3）置于55℃作用5分钟，加入100μL样品稀释液，混匀取上清。

二、在DNase free 的离心管中配制荧光定量PCR反应体系

三、按照以下方法设定荧光定量PCR反应

设置荧光基团为Fam，淬灭基团为BHQ，参比基团为None。退火延伸步骤中采集荧光数据。

四、结果判定

阳性对照：Ct值<35且有明显扩增曲线，呈典型的S型曲线。

阴性对照：无Ct值，无明显扩增曲线，结果成立。

待检样品：Ct值>40或无，则为阴性。

35<Ct<40，且有S形扩增曲线，则为可疑。若无明显扩增曲线，则为阴性。可疑样品需重新处理样品后再次检测，若Ct<40且出现S形曲线，则为阳性，反之为阴性。

Ct≤35，且有明显的S形扩增曲线则为阳性。若扩增曲线呈不规则形状需重新检测。

注意事项

（1） 所有试剂应按照规定温度储存。请勿反复冻融。

（2） 检测过程应按照分区（试剂准备区、样本制备区、核酸扩增区）进行。各区物品专用，不得交叉使用，避免污染。

（3） 检测前后均需要对操作区进行消毒，消毒方式可以采用75%乙醇或核酸消除剂等。耗材（包括吸头、PCR管）均需要无酶处理或使用商品化的无酶耗材。

（4） 为了避免对检测结果的影响，应避免使用含有荧光物质的手套，避免用手直接接触各项试剂，预防交叉污染。

（5） 采集全血时应当使用jv橼酸钠抗凝，而不要使用肝素、EDTA。

（6） 样品处理过程中应当防止交叉污染，推荐按照以下加样顺序加样，依次为阴性对照、待检测样本、阳性对照。

（7） 使用阳性对照时应特别注意防止污染。

（8） PCR反应完成后，用完的PCR管直接丢弃，严禁在实验室开盖，以防止气溶胶污染。

（9） 为防止试剂盒污染，请勿将不同批号试剂盒混用。