产品信息

产品描述

抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）是抗体发挥作用的方式之一，当IgG抗体通过Fab段与靶细胞（病毒感染的细胞及肿瘤细胞）表面抗原决定簇特异性结合后，其Fc段可与有FcγR的杀伤细胞（NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞）等效应细胞结合，触发效应细胞的杀伤活性，直接杀伤靶细胞（病毒感染的细胞及肿瘤细胞）。

图：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）

ADCC检测用Jurkat效应细胞株为改造后的NFAT-Luc-FcγRIIIa Jurkat稳定细胞株（原始株来源于中科院细胞库），可由CD20抗体，B细胞淋巴瘤细胞（Raji、PBMC、WIL2-S细胞系等）作为靶细胞来建立ADCC生物学活性检测方法。YEASEN开发的Jurkat效应细胞株无菌、无支原体污染，细胞株为单克隆细胞株，可用于ADCC作用机制验证、糖基化水平检测、抗体筛选等应用。

产品组分

运输与保存方法

干冰运输。收到之后如不立即复苏，请立即转入-80℃保存或液氮储存。

产品应用

1）. Jurkat效应细胞株运输与保存

【注】：细胞株对温度非常敏感，避免反复冻融。收到产品后，如果暂时不使用，请整瓶直接放到-80℃冻存或液氮内。

2. Jurkat细胞株复苏使用特别注意

打开水浴锅，等待升温达到设置的37 ℃后，放入配制好的种子培养基进行预热30±10 min，冻存管立即置于37℃水浴中解冻（控制在3 min内），溶解*即可拿出，解冻过程中勿使水浴锅水面浸过冻存管管口。此细胞株血清使用要求严格，检测时使用推荐超低 IgG胎牛血清。（推荐：货号:1921005PG，Gibco）

2）.抗体检测ADCC

配制细胞：将Jurkat效应细胞、raji靶细胞株200 g或1000 rpm 离心5 min 后用ADCC缓冲液（RPMI 1640培养基+4%低IgG FBS）重悬洗涤一次后，计数，调节活细胞密度（raji推荐5E5 Cells/mL；Jurkat推荐3E6 Cells/mL）可进行调试标靶比， Jurkat效应细胞株密度建议不调整。细胞株活率＞95%。方可进行实验。一般活率在98-99%之间。

稀释抗体：将抗体调节较高浓度成20 µg/mL后，进行梯度稀释，低浓度时如3 µg/mL可按2-3倍进行梯度稀释；高浓度可按5倍稀释。先确定细胞的检测抗体浓度范围后，再进行浓度和梯度稀释比例的调整。

1、将75 µL ADCC Buffer添加到96孔板的最外面的孔中，封液，防止蒸发。

2、轻轻吹打raji细胞悬液，加入25 µL细胞悬液每孔。

3、从抗体稀释板中每孔加入25 µL抗体稀释系列，加入到细胞孔内。空白不加抗体，加入25 µL ADCC缓冲液。建议从低浓度到高浓度进行添加。

4、轻轻吹打Jurkat效应细胞悬液，然后在实验台上添加25 µL Jurkat效应细胞，则每孔抗体浓度稀释三倍。（母液浓度为3 µg/mL，则检测起始起始浓度为1 µg/mL。）

5、用盖子盖住板，在37°C加湿的CO₂中孵育6小时。

6、从37°C的培养箱中取出检测板，并将其平衡到环境温度(22-25°C)，一般放置20-30 min即可。

7、使用手动多通道移液管，添加75 µL Bio-Glo™荧光素酶分析试剂到所有内部96孔板；避免制造任何泡沫。孵育5分钟后用酶标仪在白板中读取相对光单位（relative light units,RLU）数值，并按照以反应-阴性作图。

阴性：Jurkat效应细胞株+靶细胞，不含抗体，Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit检测值

反应：Jurkat效应细胞株+靶细胞，含抗体，Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit检测值

例：TECAN Spark 酶标仪检测设置：Luminescence，360-700 nm，实验检测时间设为10000 m sec；settle time：1 sec；

SpectraMax M5酶标仪检测使用设置：Luminescence，All  nm，实验检测时间设为500-1000m sec；settle time：1 sec。

3）实验结果

①抗体检测：

TECAN Spark 酶标仪检测设置：Luminescence，360-700 nm，实验检测时间设为10000 m sec；settle time：1 sec；

使用3 µg/mL母液抗体浓度，按2.5倍稀释，稀释13倍；抗体为：Rituximab, E:T=6:1

图：检测值比较明显值在(log -10至-6的区间内)

注意事项

1、反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将所有试剂平衡至室温（20-25℃）再使用。

2、Firefly Glo Luciferase Reporter Gene Assay Kit应在环境温度不超过27℃使用，使用时解冻后继续在室温下孵育20-30分钟，和96孔白板温度保持一致。

3、检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置检测时间段和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。

4、检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。

5、本产品仅作科研用途，禁止应用于人体。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

HB220330