人神经母细胞瘤细胞（STR鉴定）

SK-N-SH细胞 

细胞培养的原理和步骤，简单好用以及精确！

今天我们要讲解的是，细胞培养的原理和步骤，简单好用以及精确，学完之后，相信你对细胞培养将不再陌生。接下来就开始今天的学习吧！

细胞培养:体外模拟体内需要的生长条件（温度，营养等），然后加上一些处理条件，比如做药物筛选，就可以做抗性基因的表达的筛选，比如还可以测定某个基因敲低或是过表达的产物，这个当然要结合WB来看最后基因的表达产物是否升高哦，细胞培养的应用还有很多。

细胞培养的基本原理：细胞传代（生存空间和营养不足，长得太密，代谢废物太多，要洗洗，同时也要分离出一部分细胞，要加入新的培养液），换液（生存空间和营养剩余，但是代谢废物太多，要洗洗，要吃饭，才能长好，所以要洗和加入新鲜培养基），冻存（太多了，先存起来，液氮里面里就是低温，保存能量，活得久），复苏（解冻，恢复吃饭的能力，恢复生长。）这四步。

细胞培养的基本步骤（一定要明白每个步骤的意义和目的）：

01细胞传代（贴壁细胞）：

试剂：PBS,胰酶，含血清的培养基；

流程：显微镜下看一看培养皿里的细胞多不多，太多（80%~90%）会导致代谢废物很多，先吸掉废液，再用PBS洗一洗，同时太多会导致细胞黏在一起，这时候就需要加点胰酶消除它们之间的粘性，是否消除完，在显微镜下看一看，看完加入适宜的含血清的培养基，中和一下胰酶，这叫吹打，除此之外，细胞太多了，把一部分细胞移出来，加入适量的培养基放入孵箱继续培养，这叫传代。

02细胞换液：

试剂：PBS，含血清的培养基；

流程：先吸掉代谢废物（即细胞瓶中的培养液），再用PBS洗一洗，由于细胞长得不是很多，细胞之间没有黏在一起，因此不需要加入胰酶来消除它们之间的粘性。由于细胞要吃饭，加入新鲜的含血清的培养基，最后放到孵箱里面进行培养。

03细胞冻存：

试剂：冻存液，PBS，胰酶，含血清的培养基；

流程：要冻存，先配置冻存液，冻存液包含了：DMSO：防止在低温（零度以下至-196℃）保存细胞时，细胞内液会形成冰晶，渗透压会发生改变，细胞结构会出现紊乱，会导致细胞出现损伤。冻存液制备时，一般需与血清一起配置：因为两者互融时，会散发热量，所以冻存液需提前制备。

因为细胞太多了，需要冻存，所以要先看一看，吸一吸，洗一洗，分一分，中和一下，吹打制成细胞悬液，离心，吸掉上清液，加入冻存液，轻轻吹吸均匀，每管等量1ml装入冻存管，4℃20min,-20℃30min,-80℃过夜，最后放入液氮罐。

04细胞复苏：

试剂：含血清的培养基；

流程：从液氮中取出冻存管，迅速（小于3min）置于37℃水浴锅中，解冻时，边晃动边观察，当看到只有一小块冰存在时，即可从水浴锅中取出，打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀，1000r/min,离心五分钟，吸掉上清液，沉淀中加入适量培养液，放入孵箱中，培养。还有就是：复苏的细胞，需要在24小时后，换一次培养液。

最后：在这里特别感谢B站上无私分享的细胞培养的视频资源，正是你们的分享，帮助了我，我也会继续把我学到的继续分享，帮助更多的人！如果大家想要获得这份视频资源的话，可以在后台私聊小编获取哦，里面关于细胞培养的知识讲解的超级详细！明天我会继续介绍细胞培养的一些注意事项以及WB的操作的步骤和原理。

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随着细胞培养技术的不断发展和普及，细胞培养已经成为细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的重要工具。然而，要进行一次成功的细胞培养并不是件轻松简单的事情。

要想在一次细胞培养过程中获得足量且优质的培养物，通常要做到以下几点：活力好且无污染的种子细胞；适合该细胞生长的*培养基；安全无污染的试剂耗材；严格的无菌操作；完备的细胞培养知识体系。在这几点当中，有些小的细节往往容易被忽视，快来看看你是否中过招吧！

1.及时保种—未雨绸缪，有备无患：就算是细胞培养经验再丰富，细胞房条件再好，也无法100%避免微生物污染。一旦培养物发生污染，将会很难补救。所以，在拿到种子细胞后，及时“备份”不失为一种明智之举。具体做法是：如果拿到的是一瓶密度合适的活细胞（以T25培养瓶为例）--第一次传代时，一半细胞直接冻存一支保种，剩下一半细胞接种至一个（或多个，比例视细胞增殖速度、细胞类型而定）新的培养瓶；如果拿到的是冻存管--先复苏至一个培养瓶，待细胞长到传代密度后，按上面活细胞处理方法保种。这样一来，可以大大减少培养物还未大量扩增就被污染或状态差导致无种子可用的尴尬境地啦！

2.PBS的选用：传代之前需要用PBS洗去残留培养基是因为其中的Ca+、Mg+会降低胰蛋白酶活性。所以，一定要使用DPBS或者不含Ca+、Mg+的PBS哦！否则可能会出现消化时间变长、消化不*甚至消化不下来细胞的情况。

3. 消化时间的把握：说明书上的消化时间仅供参考，不要*遵循说明书上的消化时间，因为消化时间和细胞密度、胰酶效价甚至细胞状态有关。要边消化边在显微镜下观察（期间不要频繁晃动培养瓶），把握最佳的消化时间是细胞培养中的重中之重！

4、消化终止液的选用：一般使用2倍胰酶体积的*培养基或者等体积大豆胰蛋白酶抑制剂来终止胰酶消化作用，但在使用*培养基终止时要注意必须确认该*培养基含有10%FBS。如果该细胞采用无血清培养基培养，要使用等体积大豆胰蛋白酶抑制剂来终止消化。

5.培养基的小细节：培养基能否用来培养你的细胞的关注点除了配方是否合适、是否在保质期内、有无微生物污染以外，还需关注培养基PH值--最直观的方法是看培养基是否变成紫红色。如果培养基是紫红色，说明此时PH偏高，呈碱性。很多细胞对PH值较为敏感（如BV-2，THP-1），偏碱可能导致细胞状态差甚至凋亡。为了避免出现这种情况，可在接种细胞前将适量培养基装入培养瓶，然后放入CO2培养箱静置20Min以调整PH（非透气瓶要拧松瓶口）。可以这么做的原因是因为绝大多数培养基（L-15培养基除外）都具PH缓冲系统。

6.经常铺不匀细胞怎么办：一般使用“十字法”摇匀细胞，但如果把握不好力度和摇晃次数的话很可能无法铺匀细胞，为自己的实验或下次传代带来不必要的麻烦。解决办法是：将细胞悬液加入培养瓶后立起培养瓶轻轻吹打培养基2-3次后立即平放入培养箱，在细胞贴壁前不再搬动培养瓶。