非洲绿猴肾细胞VERO

MEM+10%FBS+1%P/S

贴壁生长

细胞死亡及生长异常

1、首先讲一下细胞生长缓慢的原因：

a)更换了血清或者培养基，细胞需要一段时间适应一下；

b)由于细胞的特殊种类，培养基中缺少某些生长因子；

c)培养基中有少量真菌或者细菌污染；

d)传代的时候细胞密度过低；

e)细胞状态老化；

f)支原体污染。

2、解决上述问题的方法：

a)如果实验室没有某种细胞最适宜的培养基，可以先用原培养条件冻存一些，然后逐渐增加新的培养基比例，25%、50%、75%到100%，传代3-5次后，让细胞慢慢适应。

b)判断是不是培养基发生污染，可以先不加抗生素，观察细胞状态。

c)增加细胞的接种密度。

d)发现细胞老化的时候，及时更换新的细胞。

e)如果怀疑是支原体污染，一定要隔离疑似污染的培养皿，及时清洁消毒孵箱。

3、造成细胞死亡的原因：

a)细胞消化过度；

b)没有及时换液，营养成分消耗殆尽；

c)如果前一天细胞的状态很好，换液之后就全死了，应该考虑是否是培养基或者血清的问题。

4、如何判定细胞是否发生支原体污染：可以选用直接培养法、荧光染色或PCR方法检测，比较常用的是PCR。当细胞发生支原体污染时，原则上是能够去除支原体的，但是整个过程耗时耗力，还要考验个人操作能力。所以如果不是处于细胞存量很少的情况下，建议发现污染时立刻弃掉，重新培养。

5、如果孵箱中只是某种细胞持续性大量死亡，而其他细胞状态都没问题的话，基本上可以确定就是孵箱存在特异性感染这类细胞的真菌或细菌，遇到这种情况，小六儿也不知道该怎么做，只能是先停一段时间看看。。。。。。

5、其他注意事项：每个星期都要更换孵箱底盘中的水（紫外照射后超纯水）；每两周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新洁尔灭擦拭一遍（都用超纯水配制）；可以在孵箱底部放一个烧杯，里面放入饱和硫酸铜，可以抑制霉菌生长。不过也有人说硫酸铜会改变孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情况很严重，建议不要使用。

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人胆囊上皮细胞永生化+GFP

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人神经母细胞瘤细胞 sh-sy5y转染野生型

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小鼠骨髓巨噬细胞永生化

小鼠角膜上皮细胞永生化

非洲绿猴肾细胞VERO

细胞复苏

细胞复苏和冻存讲究“慢冻快溶”，复苏时一定要将冻存在液氮或-80℃中凝固的细胞冻存液快速融化至37℃，使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

复苏准备

➤打开水浴锅加热至37℃。

➤ 超净台上放好离心管（一般15ml的），细胞培养瓶，移液管，紫外灭菌至少20至30分钟，吹风5至10分钟除去臭氧。

➤37℃预热好要复苏细胞的培养液，也可以不用预热培养液，根据细胞情况选择。

➤向离心管中加约5至10ml培养液，从液氮罐或-80℃中取出冻存细胞，立即将冻存管放入37℃水浴中并轻轻摇动，待融化后（约2min即可）立即将解冻的细胞转移至含培养液的离心管中，800-1000rpm下离心5min，弃上清，加适量*培养液轻轻吹打重悬细胞后转移至细胞培养瓶中，轻晃使瓶底液体分散均匀，标好细胞名称、代数、复苏日期，显微镜下观察后放入37℃，5%CO2培养箱中。一般贴壁细胞过夜即可贴壁，换液和传代时间根据不同细胞生长情况而定。

细胞复苏注意事项

➤复苏时动作要快，尽量减少胞内形成冰晶，影响复苏后细胞活率。

➤ 融化时尽量不要碰到管口，以免容易造成污染。

➤若一次性需要复苏细胞很多，可以分批水浴解冻，防止传热不佳使得细胞融化时间延长。

➤若需要同时复苏好几种细胞，提前在离心管和培养瓶上做好标记，或记住自己摆放的位置，不要弄混乱。