猪髋动脉内皮细胞 PIEC 

1640+10%FBS+1%P/S 

贴壁生长

细胞培养基本知识

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背 景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施 亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下：

上皮细胞培养

视网膜色素上皮细胞

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜， 因此培养在有胶原的底物上可能利于生长， 另外人或小鼠表皮细胞培养在以 3T3 细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低 PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。以表皮细胞为例， 用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞， 其法如下：

1、 取材：外科植皮或手术残余皮肤小块， 早产流产儿皮肤更好， 取角化层薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小块。

2、置 0.02%EDTA 中，室温，5 分钟。

3、换入 0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

4、分离：取出皮块，用血管或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用 80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle 加 20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2 温箱培养。

内皮细胞培养

人脑微血管内皮细胞

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：

1、产后新鲜脐带，无菌剪取 10—15 厘米长一段，如不能立即培养，可于 12 小 时内保存于 4℃。

2、用三通注射器吸取温 PBS 液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧， 以防液体返流。

3、用血管紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为 0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化 3—10 分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温 PBS 轻轻反复冲洗后，一 并注入离心管中（此步骤可重复） 。

5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温 箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

神经细胞培养

神经元与神经胶质细胞

神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象， 但很难使之增殖。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等诱发转化。

一．设备：无菌操作设备。

二．大型设备

CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜：用于准确地取材。

常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。

电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。

过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。

渗透压仪：pH剂，天平等。

三．培养器皿及手术器械

1.培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板：24-40孔，可用于开放培养。

3.培养瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

准备

一.配制培养液

（1）解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。

（2）基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。

（3）接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。

（4）维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。

二.培养基质

常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶。

三.消毒培养皿的备用

所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

（一）选材

常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。

（二）取材

脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。

（三）细胞分离与接种

神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。

（四）抑制胶质细胞生长

培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长

肺微血管内皮细胞

II型肺泡上皮细胞

气管上皮细胞

气管平滑肌细胞

支气管上皮细胞

支气管平滑肌细胞

肺成纤维细胞

肺动脉内皮细胞

肺动脉平滑肌细胞

心肌细胞

主动脉内皮细胞

心肌成纤维细胞

心脏微血管内皮细胞

主动脉瓣膜间质细胞

冠状动脉内皮细胞

冠状动脉平滑肌细胞

颈动脉内皮细胞

颈动脉平滑肌细胞

食管上皮细胞

食管平滑肌细胞

食管成纤维细胞

胃粘膜上皮细胞

胃平滑肌细胞

胃成纤维细胞

小肠粘膜上皮细胞

小肠平滑肌细胞

小肠成纤维细胞

结肠粘膜上皮细胞

结肠平滑肌细胞

结肠成纤维细胞

胆囊上皮（永生化）细胞

胆囊上皮细胞

肝内胆管上皮细胞

肝外胆管上皮细胞

肝实质细胞

肝星状细胞

肝窦内皮细胞

肝Kuffer细胞

直肠成纤维细胞

肝成纤维细胞

直肠上皮细胞

直肠平滑肌细胞

胆囊微血管内皮细胞

胆囊成纤维细胞

胆囊平滑肌细胞

胆囊动脉内皮细胞

食管癌细胞

食管纤维瘤细胞

肾小管上皮细胞

肾小球系膜细胞

肾小球内皮细胞

肾足细胞

输尿管上皮细胞

输尿管平滑肌细胞

膀胱上皮细胞

膀胱平滑肌细胞

膀胱成纤维细胞

前列腺上皮细胞

前列腺成纤维细胞

输卵管成纤维细胞

甲状腺上皮细胞

甲状腺成纤维细胞

胰腺星状细胞

胰岛细胞

肾上腺皮质细胞

肾上腺包膜成纤维细胞

扁桃体动脉内皮细胞

扁桃体动脉平滑肌细胞

腮腺肿瘤细胞

扁桃体间质细胞

颌下腺囊肿细胞

甲状腺微血管内皮细胞

扁桃体上皮细胞

扁桃体静脉平滑肌细胞

扁桃体成纤维细胞

卵巢间质细胞

输卵管上皮细胞

输卵管平滑肌细胞

子宫内膜上皮细胞

子宫平滑肌细胞

乳腺上皮细胞

乳腺成纤维细胞

乳腺导管上皮细胞

乳腺癌（肿瘤）细胞

子宫内膜间质细胞

子宫瘤细胞

乳腺癌（肿瘤）干细胞

宫颈成纤维细胞

宫颈平滑肌细胞

卵巢囊肿细胞

宫颈上皮细胞

精原细胞  

睾丸白膜上皮细胞

睾丸白膜成纤维细胞

输精管平滑肌细胞

附睾平滑肌细胞

附睾管上皮细胞

附睾成纤维细胞

宫颈癌细胞

睾丸支持细胞

子宫成纤维细胞

真皮成纤维细胞

角质形成细胞

前脂肪细胞

脂肪微血管内皮细胞

真皮毛乳头细胞

猪髋动脉内皮细胞 PIEC 

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的 重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细 胞群，在条件适宜下可生活 2－3 周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难 以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞， 以小鼠腹腔取材法最为实用， 其法如下：1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤 lml（勿注入肠内！，以 ） 刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁， 把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同时用手指从 两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、 用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧． 使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下 250g 离心 10 分钟后，去上清，加 10ml Eagle 培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生 20 一 30×106 细胞，其中 90%为巨噬细胞。

10、以 3×105 个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用 Eagle 液冲洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培养液置 CO2 温箱中。