Y迷宫实验

Y迷宫实验可用于评估小鼠的短期记忆。通过允许小鼠探索迷宫的所有三个臂，可以评估自发交替行为——一种空间工作记忆的测量，这是由啮齿动物天生想要探索以前未访问过的区域的好奇心驱动的。一只具有完整工作记忆的小鼠，因此具有完整的前额叶皮质功能，将记住以前访问过的臂，并倾向于进入最近访问较少的臂。空间参考记忆，由海马支持，也可以通过在训练期间将试验小鼠放入Y迷宫并关闭一个臂来测试。例如，在1小时的试验间隔后，小鼠应该记得它以前没有探索过的臂，并且应该更频繁地访问这个臂。本章描述了进行这两个相关测试并解释结果之前的条件、所需材料和协议。

一、 引言

阿尔茨海默病是最常见的痴呆形式，其特点是认知功能的逐渐衰退。据估计，它影响了超过60岁年龄组的6-8%的个体。临床前的小鼠模型在测试痴呆和认知障碍的潜在病理生理学以及筛选和开发新药治疗方面已被证明是有用的。本章描述了两种行为测试，用于检测工作记忆和参考记忆，可以使用同一设备——一个封闭的Y迷宫来进行。

基于其设计基础，Y迷宫可用于评估小鼠的短期记忆。例如，自发交替，一种测量空间工作记忆的方法，可以通过允许小鼠自由探索迷宫的所有三个臂来评估，这种行为是由啮齿动物探索以前未访问过的区域的天生好奇心驱动的。一个具有良好工作记忆的小鼠将记得它已经访问过的迷宫的臂，并将倾向于进入最近访问较少的臂。这需要大脑的几个不同区域，如海马和前额叶皮质之间的互动。测试是使用一个Y形迷宫进行的，迷宫有三个浅色的、不透明的臂，它们以120°的角度相互定位。小鼠在迷宫上的特定位置引入，并允许在短时间内自由探索臂。当小鼠的所有四肢都在一个臂内时，认为发生了进入臂的行为。交替定义为连续并且不重复的进入所有三个臂。然后，记录臂入口和交替的次数，以计算交替行为的百分比。高百分比被视为良好的工作记忆，因为这表明小鼠已经回忆起它已经访问过的臂。

空间参考记忆可以通过在训练期间将测试小鼠放入Y迷宫并关闭一个迷宫臂来测试（训练协议）。这个臂被为新颖臂。在一定的时间间隔（试验间隔，ITI）后，期间将小鼠从迷宫中移除，然后在移除障碍物后将小鼠重新放入迷宫（测试协议）。ITI的长度将强烈影响动物在这项任务中的表现，因为较长的ITI需要更高的记忆负载。常用的小鼠品种通常在最多4小时的ITI下在这项任务中表现良好。一些研究者使用24小时的ITI来探索长期空间记忆。小鼠应该基于远端空间线索及其与Y迷宫中自己当前位置的关系，记住它以前没有探索过的臂，并且应该比其他臂更频繁地访问这个新颖臂。然后将进入新颖臂的次数与进入其他臂的次数进行比较，以评估空间记忆的程度。在测试会议期间，对任何臂都没有偏好的小鼠表示空间记忆受损，这可能表明海马功能受损。

二、实验材料

1.实验和对照小鼠（见注释1）。

2.称重秤。

3.测试室及相邻操作员座位的房间（见注释2）。

4.浅灰色聚氯乙烯（PVC）Y形隔间（21 × 7 × 15.5厘米），三个臂长相等（图1）。

5.用来阻挡迷宫一臂的隔板。

6.迷宫周围的三个视觉线索标志物（见注释3）。

7.容器装Y迷宫，以防老鼠逃跑。

8.摄像头/相机（见注释4）。

9.支架用来将摄像头放置在迷宫上方的较高位置。

10.visutrack行为学分析软件（见注释5）。

11.喷雾瓶装有70%的乙醇和纸巾（见注释6）。

三、实验前的准备

1.实验前至少7天让小鼠适应，以便所有动物熟悉房间、工作人员、气味和噪音（见注释7）。

2.在行为学研究的早上称量小鼠并记录信息，包括研究标题和小鼠品系。

3.使用乙醇喷雾瓶和纸巾确保Y迷宫在测试前清洁。

4.清洁后确保迷宫干燥。

5.将摄像头放置在Y迷宫上方的支架上，并通过延长USB线缆连接到电脑（见注释8）。

6.在测试前1小时将小鼠放入行为测试室中，让它们适应条件。

四、 短期记忆的测试——自发性交替

1.标记迷宫的三个臂为A、B和C。

2.让行为学软件与Y迷宫相机连接成功并调整清晰度，全面的拍摄到迷宫里的老鼠。

3.将测试动物放置在标有A的臂的远端，面向迷宫中心，轻轻地抓住尾巴的基部。

4.离开测试室。

5.让小鼠自由探索迷宫5/8/10分钟。

6.停止录像并保存文件。

7.将小鼠从迷宫中取出，放回原笼。

8.在进行下一个动物之前，清洁迷宫的所有墙壁和地面。

9.实验结束并测试了所有的小鼠后，将所有小鼠放回保持室中的家笼。

10.清洁所有设备并收拾好。

11.检查视频并记录所有进入臂的次数和交替次数（见注释9）。

12.使用以下公式计算百分比（%）交替：

五、 空间参考记忆测试——新颖臂测试

1.小鼠适应期后，如上述标记迷宫的三个臂为A、B和C。

2.用隔板关闭其中一个臂（图2）（见注释10）。记录哪个臂被关闭。

3.通过USB采集卡缆将摄像头连接到电脑并开始录像（见注释8）

4.将动物面向中心放入一个开放的臂中，并记录动物被放置在哪个臂（见注释11）。

5.离开行为测试室。

7.按下visutrack软件的的开始分析键，并计时15分钟。

8.让动物自由探索迷宫15分钟。

9.15分钟后，停止录像。

10.将测试小鼠返回其饲养笼。

11.移除隔板。

12.等待1小时（或预设的ITI所需的时间长度）并再次开始录像。

13.用VisuTrack设置定时器为5分钟。

14.将相同的测试小鼠放置在之前试验中使用的同一臂的远端，面向迷宫中心。

15.离开测试室并按下定时器的开始键。

16.让动物自由探索迷宫5分钟。

17.停止录像并保存文件。

18.将小鼠从迷宫中取出，放回家笼。

19.在进行下一个动物之前，清洁迷宫的所有墙壁和地面。

20.实验结束时，将所有小鼠返回保持室，清洁所有设备并收拾好。

21.使用Visutrack软件分析测试期间进入所有臂的总行走距离。

22.识别迷宫的起点、新颖的臂和其他臂，并记录每个臂的进入次数以及在每个臂中停留的时间（见注释12）。

六、注释

1.选择的小鼠种类应该能代表认知或记忆障碍/增强的某个方面，例如慢性应激模型、加速衰老的遗传模型或潜在记忆增强药物的测试。最重要的是，所有程序应得到相应机构的批准。

2.使用单独的房间很重要，因为它最小化了操作者干预或对测试结果产生不当影响的可能性。在此基础上，测试期间设施内的环境噪音应尽量减少。同样重要的是，动物保持区域内也应满足此条件，因为噪音可能会增加动物的压力水平，并导致认知障碍。

3.这些可以是圆形和方形的图片，用来帮助老鼠识别与新奇性相关联的迷宫臂。确保作为远距离空间线索的物体在实验过程中不会移动。

4.使用摄像头是为了能远程观察所有情况。同样，这有助于最小化直接观察者可能对测试结果产生的不当影响。

5.用于分析动物行为的软件。也可以使用其他软件，但操作者应确保所需的输出测量值包含在其特性中。

6.这仅仅是为了在测试运行前和期间清洁迷宫，因为残留的气味和物质可能会影响测试结果。

7.同样，这是所有行为学研究中应采取的步骤，以减少动物的压力，从而提高研究结果的可重复性和准确性。此外，至少在行为测试前24小时，设施内不应进行动物的淘汰或采血。在整个行为测试过程中应保持低环境噪音。

8.在电脑屏幕上检查图像时，确保可以看到迷宫的所有区域。

9.如果老鼠用全部四只爪子进入迷宫的一个臂（A、B或C），则记录为一次进入。交替定义为老鼠连续进入所有三个臂。为了识别自发交替，使用了重叠技术。例如，A–C–B–C–A的模式包含两次交替。

10.用于阻塞的臂应随机选择，并在小鼠间轮换。

11.这也应在不同的运行和测试小鼠之间随机化。

12.具有完整空间参考记忆的老鼠应该进入并在新奇臂中花费的时间比迷宫的其他臂多。然而，我们和其他人注意到，小鼠在研究初期倾向于在起始臂逗留，因此这个臂可能被排除在比较基准之外。空间参考记忆受损的小鼠将无法识别新奇臂，因为它们无法回忆起在研究预运行阶段哪个臂被阻塞。记忆受损表现为对新奇臂和其他臂的区分缺失。