VisuGait 动物步态分析系统是通过脚印光亮折射技术，采用高速摄像机采集移动中的大小鼠行走过程中的足印信息，然后利用上海欣软自主开发的足印步态分析系统自动识别分析小鼠的步态指标，以评价小鼠的运动和空间学习能力。评价指标包括：触地面积、摆动速度、摆动时长、制动时长、步行周期、前后肢步宽、正常步序比等等，以此客观评价PD模型的步态改变。

动物步态分析系统可用于评价神经创伤、神经性、神经疾病、以及疼痛症状群的动物模型。该系统应用范围包括：脊索损伤、神经性疼痛、关节炎、中风、帕金森病、运动失调、脑损伤、外周神经损伤等疾病的研究。通过步态分析，了解神经源性疾病发展过程、评价治疗方法的效果和筛选治疗药物。

帕金森氏症导致肢体动作僵硬和协调性降低。步态分析系统通过测量动物模型中的脚间距离、摆动时相、支撑方式和正常步序比等参数评估运动协调性。

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界范围内第二大神经退行性疾病，由于目前并未开发出前期的诊断方法，在病程中后期已无法治，临床上多采用保守治疗，药物缓解症状和手术辅助治疗。目前常用左旋多的巴来弥补多巴胺能神经元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是这种药物缓解PD症状依赖于多巴脱羧酶的催化而发挥药效，随着晚期PD病人的神经元缺失，这种酶也将减少，只能在早期发挥比较明显的作用，加大药量的同时也将产生更加明显的副作用，除了增加肝肾负担以外，还会引起不自主运动和精神错乱等症状，因此，继续探索PD的发病机制，寻找更加合适的药物靶标挽救神经元的缺失并探索合适的药物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种神经退行性疾病（Neurodegenerative disease），具有不断演变的复杂性。是以黑质-纹状体多巴胺能神经元的严重缺失以及路易小体和神经突触内含物的积累和扩散为主要病理标志的神经系统疾病。帕金森病被认为是继阿尔茨海默病之后第二大的神经退行性疾病，成为世界上患者增长速度最快的神经退行性疾病，自1990年到2015年的25年间，病患人数增长已一倍，达到600多万。随着全球老龄化愈加严重，预计到2040年，病患人数将再增长一倍。PD的发病机制和病因至今尚未明确， 并没有任何一种独立学说能够阐明其分子致病机制，已经证明的分子机制包括氧化应激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的过量产生、α-突触核蛋白（α-synuclein）沉积、多巴胺（DA）合成减少或线粒体功能障碍等。主要影响运动神经系统，临床症状主要包括：1.运动症状：静止性震颤、僵硬、步态异常等。2.睡眠障碍、认知障碍和抑郁等。

为此，探究 PD 致病机制，阐明神经元缺失的分子机理或许是突破现有PD治疗策略的重要方向。

实验方法

实验材料：

1. A53T转基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均为C57BL/6J）。

2. 10%酒精用于擦拭步态玻璃板。

注：75%酒精气味刺激性大，频繁使用将导致小鼠不愿通过跑道。

3. 卫生纸。

4. 空笼盒。

行为学测试步骤包括：

（1）VisuGait 动物步态分析系统软件，该软件从位于t台跑道下方的摄像机接收信息，并检测由于对跑道表面施加压力(例如，通过放置爪子)而从跑道表面反射的光线。

（2）把老鼠放到t台的一边。

（3）通过简单的按钮点击，以电子方式启动系统。

（4）让动物走到跑道的另一边。

模型建立与药物处理：目前PD常用模型有神经毒素模型和基因编辑模型，其中神经毒素模型应用更加广泛。本课题两种模型均有涉及，对PD模型A53T转基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小动物麻醉的机对小鼠按推荐计量使用异氟的烷进行麻醉后固定于脑立体定位仪上，通过颅骨的钻在小鼠颅骨上钻孔，将显微注射针植入钻孔侧大脑纹状体区域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）对敲除小鼠纹状体注射，联同使用治疗药物21天。

动物生存环境：将雌雄小鼠分开饲养每笼4-5只，分笼可避免发情和交配引起的激素水平改变，影响行为学的测试。室温控制在22-25℃，12-12小时光暗循环的安静环境中。给予充足的食物和饮用水。

注：实验动物生存环境一定要安静， 惊恐状态下的小鼠，行为异常，不能反映真实行为学指标。每组小鼠最好不少于8只，以减少个体间差异，避免实验偶然性。选择12-14周龄小鼠，神经退行性疾病小鼠随着年龄增加，神经元缺失更加严重，年龄太大，在病程后期，小鼠无法直立行走，年龄太小，表型不明显，观测不到运动异常指标。

行为学测试前准备：

提前适应环境：将小鼠提前两天放入测试环境空间饲养（最好是将设备放在饲养环境测试），更换环境后，小鼠因为空调出风口方向、光线照射位置、环境气味等改变，而表现出焦虑情绪，而PD患者本身就存在非运动症状，环境可能影响实验结果。

设备调试：步态利用的是脚印光亮折射技术，建议实验者提前一天在实验预计进行的同一时间段调试设备。

注：白天和夜晚的采光不同，通道的光线明暗对脚印识别至关重要，最初光调试设备就可能要花费几个小时。其次是相机参数设置，在多数神经退行性疾病模型中，需要分时间段进行行为学测试，进入步态软件设置标尺需要用A4纸画一个实体的标尺，在课题进行过程中，最好使用同一标尺，也不要改变软件中方框的大小，因为软件是通过等比例计算摆动距离、步长、前后肢间距等长度相关指数，只有在同一标尺下，不同时间段的指标才有比较的意义。

测试前训练：步态分析的测试前训练是必要的，将实验鼠放入步态跑道上，第一次上跑道可将同笼鼠一起放入跑道5-10分钟，保持安静环境下，不进行测试，当老鼠通过通道，它会记住有一个出口可以回到笼子里和同伴待在一起，这将会是老鼠真正通过通道的动机。然后分别将实验小鼠放入跑道一端，将另一端用挡板封堵，在电脑前等待小鼠进入录像区域开始记录。

注：测试开始时，实验小鼠并不能很好适应环境，在惊恐状态下不会马上通过通道，切勿驱赶、恐吓方式促使小鼠通过跑道，一只老鼠几乎不会停留在玻璃板上超过20分钟不动，可能测试两三百只才回出现一次。在陌生环境中食物引诱的方法也不可取。在一个新的环境中，老鼠甚至不愿意尝试这种方法，因为这可能让他们觉得会威胁到健康。老鼠是全球成功的物种之一，它们非常聪明，通常会避免尝试任何新事物，除非是为了获益而承担风险。通过限制饲养粮食的量，每次通过通道后，通过奖励小食物颗粒来刺激动物穿过人行道，也有研究者这样操作。绝大多数(>95%)的小鼠在经过1-2周的训练后（动物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能够迅速地连续跑过步态设备的玻璃板。这可能是小鼠天生的探索天性所使然。特别注意介绍步态相关文献中都强调了小鼠是在自愿状态下通过通道，记录真实的步态的。