ELISA实验中对所使用的酶也有所要求，主要为纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格便宜、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，与抗体或抗原偶联后需继续保留着它的活性部分和催化能力。在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。此外，酶的底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收度高。ELISA中常用的酶为辣根过氧化酶（HRP）和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶（AP）。
HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18％，分子量为 44kD，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm 波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm 波长处有最高吸收峰。
HRP的纯度用RZ（ReinheitZahl，意为纯度数）表示，是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比，高纯度的 HRP的 RZ≥3.0。应注意的是酶变性后，RZ 可不变但活力降低，故选用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示：1 min 将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。HRP催化反应：DH2 + H2O2—— D +2H2O。
OPD是在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且有潜在的致癌作用，使用时应注意防护。而TMB无此缺点，TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。
ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。在ELISA中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为 80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。
产物为黄色的对硝基酚，在405nm 有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。在ELISA中应AP系统，其敏感性一般高 HRP系统，空白值也较低。但由于获得高纯度AP较难，稳定性较HRP低，价格较HRP高，且制备酶结合物时得率较HRP低等原因，在ELISA中一般较多采用HRP。
除HRP和AP以外，可应用于ELISA试剂中的酶还有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮（4-mehtylumbelliferone），可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可使用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。
