GU氨酸合成酶（GOGAT）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC0070

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 工作液的配制：取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入30 mL试剂一中溶解，现用现配，可分装后-20℃保存，避免反复冻融。

产品说明：

GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中，和GU氨酰胺合成酶（GS）共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。

GOGAT以NADH为电子供体，催化GU氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的GU氨酸，NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。  

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 工作液提前配置，平衡至室温。

3、 样本测定

三、GOGAT活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.5×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GOGAT活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.643×ΔA

V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol =10⁹nmol。

注意事项：

1、测定期间样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3、当A1大于1.5或者ΔA大于0.6时，建议将样本用蒸馏水稀释后测定，当ΔA过小时，可以延长酶促反应时间（10min或15min）或者加大加入的样本体积进行测量。

4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1、 取0.1g红豆芽加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA= A1-A2=1.23-1.067=0.163，按样本质量计算酶活得：

GOGAT活性（U/g 质量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.163÷0.1=524 U/g 质量。

2、 取0.1g稗草加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA= A1-A2=1.416-1.404=0.012，按样本质量计算酶活得：

GOGAT活性（U/g 质量）=321.5×ΔA÷W=321.5×0.012÷0.1=38.58 U/g 质量。

相关发表文献：

[1] Fei Ding,Qiannan Hu,Meiling Wang,et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

[2] Jie Wang,Wei Zhou,Hui Chen,et al. Ammonium Nitrogen Tolerant Chlorella Strain Screening and Its Damaging Effects on Photosynthesis. Frontier in Immunology. January 2019;(IF4.259)

[3] Meng L, Li W, Zhang S, et al. Effects of sucrose amendment on ammonia assimilation during sewage sludge composting[J]. Bioresource technology, 2016, 210: 160-166.

参考文献：

[1] del Pilar Cordovilla M, Pérez J, Ligero F, et al. Partial purification and characterization of NADH-glutamate synthase from faba bean (Vicia faba) root nodules[J]. Plant science, 2000, 150(2): 121-128.

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