SOLARBIO/索莱宝 品牌
生产厂家厂商性质
北京市所在地
糖化酶活性检测试剂
盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2670
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂一 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 液体35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
试剂一：临用前取1瓶加入20 mL提取液，充分混匀后沸水浴直至溶解（约10min），2-8℃保存4周；
标准品：10 mg无水*萄糖。临用前加1 mL提取液溶解为10 mg/mL的葡萄糖标准品备用，2-8℃保存2周；
产品说明：
糖化酶，即葡萄糖淀*酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀*酶。糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解α-1,6 糖苷键由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。多应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。
糖化酶将可溶性淀粉生成葡萄糖，碱性条件下，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后生成红棕色化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内葡萄糖的量与反应液颜色深浅成正比，以此测定糖化酶的活力。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、研钵/匀浆器/超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），
冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
培养液或其它液体：直接检测。（若有浑浊则离心后进行测定）
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至1.5、1.0、0.8、0.4、0.2、0.1mg/mL。
| 序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
| 1 | 10 | 200 | 800 | 2.0 |
| 2 | 2.0 | 150 | 50 | 1.5 |
| 3 | 2.0 | 300 | 300 | 1.0 |
| 4 | 1.0 | 320 | 80 | 0.8 |
| 5 | 0.8 | 200 | 200 | 0.4 |
| 6 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
| 7 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
实验中每个标准管需50µL标准溶液。
吸取50μL样本于1.5mLEP管中沸水浴5min作为对照管的灭活样本。
加样表：
三、糖化酶活性计算
1. 标准曲线的绘制：
根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标（y，ΔA标），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测（y，ΔA测）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。
2. 酶活性计算：
（1）按照蛋白浓度计算：
酶活性定义：在40℃每毫克蛋白每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/mg prot）=x×V样总÷（V样总×Cpr）÷T=3x÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃每克组织每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/g 质量）= x×V样总÷W÷T=3x÷W
（3）按照液体体积计算
酶活性定义：在40℃每毫升液体每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/mL）= x×V样÷V样÷T=3x
（4）按照细胞数量计算
酶活性定义：在40℃每104个细胞每小时产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
糖化酶活性（U/104 cell）= x×V样总÷500÷T=0.006x
V样：反应体系中加入的样本体积，50μL=0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，20min=0.333h；500：细胞数量，500万。
注意事项：
测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
实验实例：
取0.1g玉兰叶片加入1mL提取液冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=0.738-0.584=0.154，带入标准曲线y=0.7372x+0.0175，计算x=0.18516，按样本质量计算酶活得：
糖化酶活性（U/g 质量）=3x÷W=5.55 U/g 质量。
取0.1g肝脏加入1mL提取液冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=1.420-1.282=0.138，带入标准曲线y=0.7372x+0.0175，计算x=0.163，按样本质量计算酶活得：
糖化酶活性（U/g 质量）=3x÷W=4.89 U/g 质量。
取兔血清按照测定步骤操作，测得计算ΔA测=A测定管-A对照管=1.447-0.753=0.694，带入标准曲线y=0.7372x+0.0175，计算x=0.918，按照液体体积计算：
糖化酶活性（U/mL）=3x=2.754 U/mL。
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