Na⁺K⁺-ATP酶活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC0060
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂三：用时取1支加1 mL蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃分装保存一周。

2. 试剂六：用时加入15 mL蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。

3. 试剂七：用时加入15 mL蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。

4. 标准品：10 μmol/mL标准磷贮备液。将标准品20倍稀释，即取0.1 mL标准品加1.9 mL蒸馏水充分混匀，配成0.5 μmol/mL标准磷应用液。

5. 定磷剂的配制：按H₂O：试剂六：试剂七：试剂八=2:1:1:1（体积比）的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂根据实验用量现用现配。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
产品说明：
Na⁺K⁺- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。
ATP                  ADP + Pi        


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：

• 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞或组织样本的制备：
   细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
   组织：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在EP管中加入下列试剂）

3、定磷(在1.5mL EP管中依次加入下列试剂)

三、Na⁺K⁺-ATP酶活计算
1、血清（浆）Na⁺K⁺-ATPase活力的计算：
定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）= C标×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V总÷V样÷T
=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）
2、组织、细菌或细胞中Na⁺K⁺- ATPase活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：规定每小时每毫克组织蛋白中Na⁺K⁺- ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mg prot）= C标×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V总÷（Cpr×V样）÷T
=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷Cpr
（2）按样本质量计算：
定义：规定每小时每克组织中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/g 质量）= C标×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V总÷(V样÷V样总×W)÷T
=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W
（3）按细菌或细胞数量计算：
定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Na⁺K⁺-ATP酶分解ATP产生1μmoL无机磷的量为一个酶活力单位。
Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/10⁴ cell）= C标×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V总÷(V样÷V样总×500)÷T
=0.015×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）
C标：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.5mL；V样：加入样本体积，0.2mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒50管保证测 24份Na⁺K⁺-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
实验实例：

1. 取0.1g小鼠心脏加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算A测定=1.216，A对照=0.842，A标准=0.398，A空白管=0.004，按样本质量计算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g 质量)=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W=71.19 U/g 质量。

1. 取0.1g稗草加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算A测定=0.474，A对照=0.403，A标准=0.398，A空白=0.004，按样本质量计算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力(U/g 质量)=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W=13.52 U/g 质量。

1. 取200μL小鼠血浆稀释2倍，直接检测，A测定管=0.958，A对照=0.906，A标准=0.398，A空白=0.004，按液体体积计算酶活得：

Na⁺K⁺-ATP酶活力（U/mL）=7.5×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×2（稀释倍数）=1.98 U/mL。
相关发表文献：

1. Fangzhou Chen,Ying Zhao,Huizhao Chen,et aL. MicroRNA-98 reduces amyLoid β-protein production and improves oxidative stress and mitochondriaL dysfunction through the Notch signaLing pathway via HEY2 in ALzheimer's disease mice. InternationaL JournaL of MoLecuLar Medicine. October 2018;(IF2.928)

2. Wanxiu Cao,Jing Li,Yaoxian Chin,et aL. Transcriptomic anaLysis reveaLs effects of fucoxanthin on intestinaL

gLucose transport. JournaL of FunctionaL Foods. October 2018;(IF3.197)

1. Li M, Jiang C, Zhang Y, et al. Activities of Amphioxus GH-like protein in osmoregulation: insight into origin of vertebrate GH family[J]. International journal of endocrinology, 2017, 2017.

参考文献：
[1] Luo L G, MacLean D B. Effects of thyroid hormone on food intake, hypothalamic Na/K ATPase activity and ATP content[J]. Brain research, 2003, 973(2): 233-239.
[2] Cornelius F. Modulation of Na, K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and cholesterol. I. Steady-state kinetics[J]. Biochemistry, 2001, 40(30): 8842-8851.
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