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土壤硝酸还原酶（S-NR）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC3100
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 试剂一 | 液体30 mL×1瓶 | -20℃保存 |
| 试剂二 | 液体5 mL×1瓶 | -20℃保存 |
| 试剂三 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂四 | 液体10 mL×1瓶 | -20℃保存 |
| 试剂五 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂六 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 标准品 | 液体1 mL×1支 | -20℃保存 |
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、恒温水浴锅/水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、30-50目筛、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
新鲜土样自然风干或37 度烘箱风干，过30~50目筛。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。
NaNO2标准液的配制：用蒸馏水将标准品稀释0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL。
标准品稀释表：
| 序号 | 稀释前浓度（µmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（µmol/mL） |
| 1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
| 2 | 1 | 160 | 40 | 0.8 |
| 3 | 1 | 120 | 80 | 0.6 |
| 4 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
| 5 | 1 | 40 | 160 | 0.2 |
| 6 | 1 | 20 | 180 | 0.1 |
备注：实验中每个标准管需100µL标准溶液
样本测定：
| 试剂名称 | 1.5mLEP管 | |||
| 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
| 风干土样（g） | 0.1 | 0.1 | ||
| NaNO2标准液（μL） | 100 | |||
| 蒸馏水（μL） | 100 | 100 | 100 | |
| 试剂一（μL） | 365 | 365 | 365 | 365 |
| 试剂二（μL） | 35 | 35 | 35 | |
| 混匀后，置于37℃水浴锅/恒温培养箱反应24h。 | ||||
| 试剂三（μL） | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 试剂二（μL） | 35 | |||
| 立刻混匀， 8000rpm室温离心5min | ||||
| 上清液（μL） | 400 | 400 | 400 | 400 |
| 试剂四（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 混匀后，置于37℃水浴锅/恒温培养箱保温20min。 | ||||
| 试剂五（μL） | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 试剂六（μL） | 250 | 250 | 250 | 250 |
混匀，显色20min后，520nm下读取各管吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定- A对照，ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需检测1-2次。
三、S-NR活性计算
1、标准曲线绘制：
以0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/mL标准溶液为横坐标（x轴），ΔA标准为纵坐标（y轴）绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b，将ΔA测定代入方程得到x（μmol/mL）。
2、S-NR活性计算：
单位的定义：每g土样每天中产生1μmol NO2ˉ的量为一个 S-NR活力单位。
S-NR（U/g 质量）=x×V标准÷W÷T=0.1x÷W
V标准：反应体系中加入的标准液体积，0.1mL；W：风干土样，g；T：反应时间，1d。
注意事项：
试剂一、试剂二和试剂四在冰上放置，用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。
ΔA测定过小（小于0.01），可延长反应时间（37℃水浴时间）。
当ΔA大于1时，可以将上清液用蒸馏水稀释后，再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。
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