丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书  微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0385

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒 微量法

丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒 微量法

溶液的配制：

1. 试剂二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。

2. 工作液的配制：临用前把5.75mL试剂四、一支试剂五、0.45mL试剂六、1.75mL试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用（共15.45mL，约85T）；用不完的试剂-20℃分装保存，可保存4周。避免反复冻融。

产品说明：

PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。

Pyruvic Acid + Thiamine Pyrophosphate             Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate

Dichlorophenolindophenol(605nm) + Hydroxyethyl Thiamine Pyrophosphate       Reduced Dichlorophenolindophenol

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：称取约 0.1g 组织，加入1mL 试剂一和 10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4 ℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细胞或者细菌样本：先收集500万细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；之后加入1mL试剂一和 10μL试剂二，冰浴超声波破碎细菌（功率200 W，超声3 s，间隔7 s，总时间5 min）；然后11000g，4℃，离心10 min，

取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆）及其它液体样本：直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 每个样本需要180μL工作液，根据实验所需取出一定量的工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴锅中水浴10min。

3、 空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混匀，立即记录605nm处10s处吸光值A1和 1min10s后的吸光值A2，计算ΔA空白=A1-A2。空白管只需测1-2次。

4、 测定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL样本，混匀，立即记录605nm处10s处吸光值A3和1min10s后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。

三、PDH活性计算

a.用微量比色皿测定的计算公式如下

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T

                        =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×W) ÷T

                        =913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T

                        =1.828×(ΔA测定-ΔA空白)

4. 按样本体积计算

单位的定义：每mL液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/mL）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T

=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)

   V反总：反应体系总体积，1.9×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1．按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T

                        =1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2．按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/g 质量）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×W) ÷T

                       =1827.62×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3．按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×500) ÷T

                        =3.655×(ΔA测定-ΔA空白)

4．按样本体积计算

单位的定义：每mL液体在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/mL）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T

=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，1.9×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/ cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测，以免变性和失活。

2、测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。计算公式中乘以稀释倍数。若测定管的ΔA值小于0.01，需加大样本量后重新测定，注意同步修改计算公式。

3、由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。

实验实例：

1、 取0.1g小鼠肝脏加入1mL试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃、11000g离心10min，取上清置冰上，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔA空白=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011，按样本质量计算酶活得：

PDH活性(U/g质量)= 913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W=1747 U/g质量。

相关发表文献：

[1] Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Rare ginsenosides ameliorate lipid overload-induced myocardial insulin resistance via modulating metabolic flexibility[J]. Phytomedicine, 2019, 58: 152745.

参考文献：

[1] Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 localizes to mitochondria and enhances pyruvate dehydrogenase activity in skeletal myotubes[J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.

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