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α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0715
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 试剂一 | 液体110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 液体0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
| 试剂三 | 液体28 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂四 | 液体0.5 mL×1支 | 2-8℃保存 |
| 试剂五 | 粉剂×2支 | 2-8℃保存 |
| 试剂六 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
| 试剂七 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
| 试剂八 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；
试剂五：临用前取1支试剂五，加入1 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；
试剂六：临用前取1支试剂六，加入1.5 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；
试剂七：临用前取1支试剂七，加入1 mL试剂三，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融（1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂）；
试剂八：临用前取1支试剂八，加入0.4mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；
工作液的配制：临用前依次取8.05 mL试剂三、0.2 mL试剂四、1 mL试剂五、1.25 mL试剂六、0.5 mL试剂七（共11mL，约55T），充分混合待用，现用现配。
产品说明：
α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅*A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅*A生成琥珀酰辅*A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。
比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。
由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例：
取0.1g稗草进行样本处理，将取上清稀释2倍后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A4-A3=0.3243-0.3115=0.0128，ΔA空白=A2-A1=0，按样本质量计算酶活得：
α-KGDH活性（U/g 质量）=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W×2（稀释倍数）=381.056 U/g 质量。
取0.1g小鼠肝脏进行样本处理，4 ℃ 11000g离心10min，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A4-A3=1.2123-0.9623=0.2500，ΔA空白=A2-A1=0，按样本质量计算酶活得：
α-KGDH活性（U/g 质量）=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W=3721.25 U/g 质量。
相关发表文献：
Jianyun Yue,Changjian Du,Jing Ji,et al. Inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity afects adventitious root growth in poplar via changes in GABA shunt. Planta. July 2018;(IF3.06)
Xiao Li,Qi Zhao,Jianni Qi,et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018; (IF3.571)
参考文献：
Park L C H, Calingasan N Y, Sheu K F R, et al. Quantitative α-ketoglutarate dehydrogenase activity staining in brain sections and in cultured cells[J]. Analytical biochemistry, 2000, 277(1): 86-93.
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