植酸含量检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5845

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入4mL试剂一，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂三：临用前加入2.36mL蒸馏水充分溶解，再将枪头伸入液面下缓慢加入0.64mL浓硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

3、 试剂四：临用前加入15mL蒸馏水充分溶解，再将枪头伸入液面下缓慢加入15μL浓硫酸，充分混合；2-8℃可以保存4周；

4、 工作液：临用前根据样本量按照试剂三：试剂四=1mL:5 mL(共6mL，40T)的比例混匀，配置后当天用完；

5、 标准品：临用前加入1.08mL试剂一充分溶解，配制成10μmol/mL植酸标准品，2-8℃保存4周；

6、 250nmol/mL标准品的配制：临用前取50μL 10μmol/mL植酸标准品和450μL蒸馏水混合为1μmol/mL标准品（即1000nmol/mL）；再取250μL 1000nmol/mL标准品和750μL蒸馏水混合配制成250nmol/mL植酸标准品，用于下述操作表标准管测定，现配现用。

产品说明：

植酸（Phytic acid），又名肌醇六磷酸、环己六醇六磷酸，普遍存在于真核细胞，在许多细胞活动中发挥关键作用，如：维持无机磷稳态、参与植物激素信号转导、作为酶的辅助因子参与DNA修复、RNA编辑和mRNA输出。植酸在植物发芽和生长过程中提供主要磷源，广泛存在于谷类、豆类、水果、蔬菜和干果等植物性食物中。

在一定的环境条件下，植酸酶可以分解植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）产生无机磷和肌醇衍生物，在酸性条件下，无机磷和钼酸铵显色剂发生反应，产生蓝色的钼蓝物质，其在700nm有特征吸收峰，通过测定无机磷的含量，可计算出植酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、浓硫酸（>98%，AR）、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 新鲜植物样本：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分匀浆后，常温震荡2h，然后于4℃，10000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 10000g离心10min后取上清待测。

2. 干粉类植物样本：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~20的比例（建议称取约0.05g，加入1mL提取液一）加入提取液一，充分匀浆后，常温震荡2h，然后于4℃，10000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 10000g离心10min后取上清待测。

3. 液体样本：取100μL液体加入1mL提取液一，常温震荡2h，然后于4℃，10000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 10000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2 mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至700nm，可见分光光度计蒸馏水调零。

2．操作表：（1.5mLEP管中加入下列试剂）

三、植酸含量计算

1. 按样本蛋白浓度计算

植酸含量（nmol/mg prot）= ΔA测定×C标÷ΔA标准×V样÷(V样×Cpr) =250×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2. 按样本质量计算

植酸含量（nmol/g 质量）= ΔA测定×C标÷ΔA标准×(V上清+V提取液二)÷(W×V上清÷V提取液一)

=296.875×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3. 按液体体积计算

植酸含量（nmol/mL）=ΔA测定×C标÷ΔA标准×(V上清+V提取液二)÷[V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]

=3265.625×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准管浓度，250nmol/mL；V样：加入样本体积，0.12mL；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V液体：液体样本体积，0.1mL；W：样本质量，g。

注意事项：

1、 如果∆A测定小于0.010或测定管吸光值接近空白管，可以增加样本量后再进行测定；如果∆A测定大于1，建议将样本上清用蒸馏水适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2、 如果样本加入工作液后出现浑浊，建议将样本上清用蒸馏水适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

3、 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。

实验实例：

1. 称取0.1044g洋葱样本，按照提取步骤和测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定-A对照=0.411-0.375=0.036，ΔA标准=A标准-A空白=0.811-0.096=0.715，按样本质量计算得：

植酸含量（nmol/g 质量）=296.875×ΔA测定÷ΔA标准÷W=143.18nmol/g 质量。

2. 称取0.05g小麦粉，按照提取步骤和测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定-A对照=0.331-0.188=0.143，ΔA标准=A标准-A空白=0.811-0.096=0.715，按样本质量计算得：

植酸含量（nmol/g 质量）=296.875×ΔA测定÷ΔA标准÷W=1187.5nmol/g质量。

参考文献：

[1] Senna R, Simonin V, Silva-Neto M A C, et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H, Lewis K O, Cooper B T. Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A, Egielewa S J, Ihimire E. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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