Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷
¥368qPCR SYBR Green Mix(实时荧光定量)
面议实时荧光定量qPCR预混液(SYBR Green Mix)
面议Hieff qPCR SYBR Green Mix(qPCR预混液)
面议萤火虫荧光素酶报告基因检测试
面议脱氧核糖核酸酶I,来源于牛胰腺
面议TRIeasy总RNA提取试剂
面议Agarose琼脂糖
¥158多片段一步法快速克隆试剂盒
¥410qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量)
面议Hieff Clone Plus 一步法快速克隆试剂盒
面议牛胰腺脱氧核糖核酸酶I
面议产品简介
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒,适应性广、稳定性强。试剂盒采用的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA,不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等,即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用量少,低至1 mm植物叶片即可进行实验。
本试剂盒中提供的2× Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。
组分信息
类别 | 组分编号 | 组分名称 | 10187ES05 | 10187ES50 | 10187ES70 |
Part I | 10187-A | Buffer P1 | 250 μL | 1.25 mL × 2 | 5 mL × 2 |
10187-B | Buffer P2 | 50 μL | 500 μL | 1 mL × 2 | |
Part II | 10187-C | 2 × Plant Master Mix* | 50 μL | 500 μL | 1 mL × 2 |
*2× Plant Master Mix:包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等,同时包含电泳Loading Buffer,PCR完成之后可直接电泳。
储存条件
1. 试剂10187-A【Buffer P1】,置于2-8℃保存。有效期1年。
2. 试剂10187-B【Buffer P2】,中和裂解产物,利于更长时间保存样本,置于2-8℃保存。有效期1年。
3. 试剂10187-C【2 × Plant Master Mix】,-25~-15℃保存,避免反复冻融。有效期1年。
使用说明
植物叶片
1、研磨裂解法:
a. 研磨仪破碎:将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,用研磨仪加钢珠(钢珠直径3mm左右,共2个)破碎叶片(45 Hz,1 min),叶片破碎后溶液呈现绿色,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。
b. 枪头捣碎:推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,用枪头将叶片捣碎,捣碎后溶液呈现绿色,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。
1、加热裂解法:推荐使用幼嫩叶片。将直径5 mm左右的叶片置于50 μL Buffer P1中,95℃加热5-10 min(确保裂解液 浸没叶片),较难裂解的叶片(老叶片)可适当延长时间(10-20 min),加热裂解后溶液呈现绿色,震荡混匀,瞬时离心,上清液请放在4℃备用,取1 μL用于PCR扩增。
1、直接法:推荐使用幼嫩叶片。使用打孔器或者刀,将直径1 mm左右的叶片直接加入到PCR反应体系中;复杂样本或者是长片段的扩增,推荐使用直径<1 mm的叶片。
PCR反应体系
组分 | 体积(μL) | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解产物(DNA模板) | 1 | 2 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
表1 反应体系
【注】:各组分使用前应充分混匀。
模板加入量:小于PCR反应体系的5%,过多会严重抑制PCR反应,强烈推荐加入1 μL模板。叶片直扩优先推荐研磨仪裂解法。
引物终浓度:0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。
反应体系:推荐使用20 μL或50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
对照反应:建议进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
为了更稳定的保存裂解后的模板,将转移出来的上清液,按照裂解产物(DNA模板):Buffer P2 = 5:1的比例混合,混匀后-20℃保存,稳定保存随时间和样本状态不同而有所不同。如果处理后的植物叶片上清液一周内用于PCR扩增,不用加Buffer P2,上清液请保存在-20℃。
反应条件
循环步骤 | 温度 (°C) | 时间 | 循环数 |
预变性 | 94 | 5 min | 1 |
变性 | 94 | 10 sec | 35 |
退火 | 50-65 | 20 sec | |
延伸 | 72 | 1 min/kb | |
终延伸 | 72 | 5 min | 1 |
表2 反应条件 |
【注】:
退火温度:请参考引物的理论 Tm 值,退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。
延伸时间:需要根据片段的长度来确定,对于1 kb以内的DNA片段,建议延长时间为1 min。
注意事项
做叶片实验时,建议使用新鲜采取的叶片组织,若为长期冷冻组织,需-80℃保存,应尽量避免反复冻融,以免造成模板降解,影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜,若为成熟的叶片,避免使用叶片主脉部位组织。
建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率佳。
取样时使用打孔器或者刀取适宜大小的样本,样本不同时,打孔器或者刀每次处理样本前需清洗干净。
对于叶片组织,建议取1-10 mm的叶片,过小会使PCR扩增产量低,过多会抑制PCR反应,采用加热裂解法、枪头捣碎、研磨仪破碎的方式处理植物叶片,处理后需震荡离心,务必取上清液试验,沉淀会严重抑制PCR反应。
为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
本产品仅作科研用途!
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱 | 裂解液、中和液加入比例不当,裂解混合液影响PCR体系的pH值。 | 正常条件下,中和后的裂解混合液的pH应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照5:1的量进行中和)。 |
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。 | |
模板加入量不适合。 | 在反应体系<5%范围内优化模板加入量。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐35-40循环为佳。因模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
样本间交叉污染。 | 每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。 |