Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
产品简介
CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒适用于定量检测来源于HIV-1型慢病毒载体技术制备的人源细胞产品,如CAR-T或TCR-T细胞基因组中CAR或TCR基因的拷贝数。
CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒基于荧光探针定量PCR原理,采用多重qPCR方法分别检测转移质粒上与整合或表达功能相关的DNA序列和人体细胞中单拷贝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法,计算得到样本中平均每个细胞的目的基因拷贝数,如CAR或TCR基因拷贝数水平。其定量限可以达到101 copies/μL水平。该试剂盒需要与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
产品信息
货号 | 41313ES50 / 41313ES60 |
规格 | 50 T / 100 T |
组分信息
组分编号 | 组分名称 | 41313ES50 | 41313ES60 |
41313-A | CAR/TCR qPCR Mix | 0.75 mL | 1.5 mL |
41313-B | CAR/TCR Primer&probe Mix | 200 μL | 400 μL |
41313-C | DNA Dilution Buffer | 2×1.8 mL | 4×1.8mL |
41313-D | CAR/TCR DNA Control (2.1×108 copies/μL) | 25 μL | 50 μL |
41313-E | IC* | 50 μL | 100 μL |
*IC:Internal control,内部对照。
运输和储存条件
1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。
2. 收到货后,请检查共5个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。
适用机型
包含但不限于以下仪器:
Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5;
上海宏石医疗科技:SLAN-96S。
使用说明
CAR/TCR DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
CAR/TCR DNA定量参考品是同时含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的质粒DNA,所以试剂盒的CAR/TCR DNA Control组分里,CAR/TCR和SCG的基因拷贝数是一样的。
用试剂盒中的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将CAR/TCR DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为2.1×106 copies/μL、2.1×105 copies/μL、2.1×104 copies/μL、2.1×103 copies/μL、2.1×102 copies/μL。操作如下:
1)将试剂盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室温融化,然后轻微振荡混匀,低速离心10 sec。
2)取6支干净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
3)在标记Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control,即稀释为2.1×107 copies/μL,振荡混匀后短暂快速离心10 sec,该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存(不超过6个月)**,使用时避免反复冻融。
4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****,稀释方法如下:
稀释管 | 稀释比例 | 终浓度 | |
CAR/TCR (copies/μL) | SCG (copies/μL) | ||
Std1 | 10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×106 | 2.1×106 |
Std2 | 10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×105 | 2.1×105 |
Std3 | 10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×104 | 2.1×104 |
Std4 | 10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×103 | 2.1×103 |
Std5 | 10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×102 | 2.1×102 |
表1 标准品梯度稀释
*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试2.1×106 copies/μL~2.1×102 copies/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。
**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。
***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-25~-15℃。
****为确保模板混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。
样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中CAR/TCR DNA标准品浓度(以制备加2.1×104 copies CAR/TCR DNA量的ERC为例),具体操作:
1) 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,再加入10 μL Std4,混匀,标记为ERC。
2) 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加标回收ERC纯化液。
阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:
1) 取100 μL样本基质溶液(或DNA Dilution Buffer)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为NCS。
2) 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。
无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:
1) 无模板对照NTC无需进行样本前处理,在qPCR法检测CAR/TCR DNA含量阶段开始配置即可。
2) 每管或孔中的NTC反应体系为20 μL Mix混合液(即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC)+ 10 μL DNA Dilution Buffer,建议配置3个重复孔的量。
反应体系
反应体系 | 体系(μL) |
CAR/TCR qPCR Mix* | 15 |
CAR/TCR Primer&probe Mix | 4 |
IC | 1 |
DNA template** | 10 |
总体积*** | 30 |
表2 标准品反应体系
*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)×(15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。
**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)×3。
NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS
TS (Test Sample):待测样本
ERC (Extraction Recovery Control):待测样本中加入如2.1×104 copies标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC
***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
下图为参考板位:
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | NTC | 待测样本TS1 | 待测样本TS1 | 待测样本TS1 | 标准曲线Std1 | 标准曲线Std1 | 标准曲线Std1 | |||||
B | NTC | 待测样本TS2 | 待测样本TS2 | 待测样本TS2 | 标准曲线Std2 | 标准曲线Std2 | 标准曲线Std2 | |||||
C | NTC | 待测样本TS3 | 待测样本TS3 | 待测样本TS3 | 标准曲线Std3 | 标准曲线Std3 | 标准曲线Std3 | |||||
D | 标准曲线Std4 | 标准曲线Std4 | 标准曲线Std4 | |||||||||
E | NCS | 样本加标ERC1 | 样本加标ERC1 | 样本加标ERC1 | 标准曲线Std5 | 标准曲线Std5 | 标准曲线Std5 | |||||
F | NCS | 样本加标ERC2 | 样本加标ERC2 | 样本加标ERC2 | ||||||||
G | NCS | 样本加标ERC3 | 样本加标ERC3 | 样本加标ERC3 | ||||||||
H |
表3 上机参考板位
该示例是对CAR/TCR基因拷贝数的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的CAR/TCR DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)
1)创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
2)创建2个检测探针,第一个命名为“CAR/TCR-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“None”;第二个命名为“SCG,选择报告荧光基团为“VIC”,猝灭荧光基团为“None”;再创建1个检测探针,命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加;若选择ROX校准,建议阈值线选择0.06)。
3)在“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“2100000”、“210000”、“21000”、“2100”、“210”(含义为每孔的DNA浓度,单位为copies/μL),并且在相应的“sample name”一栏中命名为“2100000 copies/μL”、“210000 copies/μL”、“21000 copies/μL”、“2100 copies/μL”、“210 copies/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。
4)扩增程序设置:设置反应体积30 μL。
循环步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
污染消化 | 37℃ | 5 min | 1 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 |
变性 | 95℃ | 15 sec | 45 |
退火/延伸(收集荧光) | 60℃ | 30 sec |
表4 扩增程序
qPCR 结果分析
1)在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2)在“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。
3)在“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为copies/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。
4)结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。
5)根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.copies) x 100%。
6)阴性质控NCS的Ct值应为Undetermined或Ct值≥35。
7)无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥38。
8)每个细胞中的CAR或TCR拷贝数=
注意事项
1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。
2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。
3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途。