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生产厂家厂商性质
上海市所在地
产品名称 | 货号 | 规格 |
Pikogreen dsDNA定量试剂盒(超敏) | AN54L038 | 200 assays |
Pikogreen dsDNA定量试剂盒(超敏) | AN54L039 | 1000 assays |
产品组分
组分 | AN54L038 | AN54L039 |
A: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Quantitation Solution | 50 mL | 250 mL |
B: Pikogreen High Sensitivity dsDNA Enhancer, 100× | 0.5 mL | 2.5 mL |
C: dsDNA Standards 0 , 0.5, 1, 2 ,4 ,6, 8 and 10 ng/uL dsDNA from calf thymus | 每组 0.1 mL(8组) | 每组 0.5 mL(8组) |
运输与保存
蓝冰运输。4℃避光保存,有效期24个月。
使用方法
使用前,将产品从储存条件下取出恢复至室温。如果100XEnchancer储存液出现沉淀,可37℃水浴溶解。每个组分应充分震荡或涡旋混匀、离心,以免造成不必要的试剂损耗。
每个待测样品对应200 μL的Pikogreen工作液。对于一个96孔板,吸取200 μL 100X Enchancer,加入到20 mL Quantitation Solution 中,涡旋混匀,配置成Pikogreen工作液,为得到最佳结果,工作液应在1 h内使用完毕。如果将工作液重新储存并在24 h内使用,结果的准确性会有轻微损失。储存过程中,增强液可能会出现沉淀现象,可以通过涡旋震荡使其重悬。
对于每个样品,吸取200 μL的工作液至黑色的96孔板微孔中。为确保结果精确可靠,建议每个测试样品和DNA标样分别做平行的3个复孔,此过程也可以使用有精确量程的移液排枪进行。黑色的检测板可以减少各测试样品间的荧光干扰。
在96孔板微孔中,每孔加入10 μL的dsDNA标样或未知样品,并用移液器轻轻混匀。
将微孔板室温避光孵育5~10 min,为得到最佳结果,孵育结束后,应立即读取检测板。也可以在6 h内读取数据,但结果的精确性会有轻微损失。
使用激发波长和发射波长在485 nm和530 nm处的酶标仪测量荧光值。
制作一条标准曲线,计算检测样品的DNA浓度(见图2)。
【注】:图2标准曲线仅供参考,您可以根据实际测得的数据自制标准曲线,从而求算样品的浓度。
图1:使用Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量试剂盒检测不同类型核酸得到的相对荧光强度 | 图2:使用Pikogreen Hig Sensitivity dsDNA 定量试剂盒制作的calf thymus DNA标准曲线(Ex/Em 485/530),左上角插图显示了低浓度DNA样本测定的曲线图。 |
注意事项
对于要检测的植物或动物来源的DNA样本,小牛胸腺DNA(Calf thymus DNA )常常作为制作DNA标样的参照物。因为Calf thymus DNA具有双链结构、高度聚合,碱基分配均匀(AT含量58%,GC42%)。如果检测样品的荧光值超过了标准曲线,那么需要将样品做进一步稀释处理。为了保持结果的一致性,务必使每孔上样量均等,且不含有其他高浓度的污染物。
2. Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量试剂盒可以测量范围在0.2~100 ng的dsDNA。对于一些不需要线性检测的样品,试剂盒检测范围可以扩展至200 ng。如需检测更低含量的样品,您可以将DNA标样用1×TE缓冲液作进一步的稀释,浓度可以稀释到0.02 ng/μL,然后按照常规程序每孔10 μL上样。
3. 对于不同种类的检测仪器,您可以优化仪器设置,以获取最佳线性度。一些可能会影响最终线性度和相对荧光强度的因素有:(1)激发和发射波长与带宽(2)截止型滤波器(3)灵敏度设置(4)移液的准确性(5)微孔板制造商。为了得到最佳结果,请使用精确校准的移液器和去RNA酶的枪头、试管以及检测板。建议检测时每个DNA标样和未知样品都设定3个复孔。如果检测时不只一块96孔板,建议每块96孔板都设定一条标准曲线,尽量减少检测板之间的误差。
表1:常见的DNA污染物对 Pikogreen High Sensitivity dsDNA 定量试剂盒的影响
复合物 | 初始浓度 | 终浓度(200 μL) | 结果 |
醋酸铵 | 100 mM | 5 mM | Pass |
醋酸钠 | 600 mM | 30 mM | Pass |
氯化钠 | 200 mM | 10 mM | Pass |
氯化镁 | 25 mM | 1.25 mM | Pass |
苯* | 2 % | 0.1 % | Pass |
乙醇 | 10 % | 0.5 % | Pass |
氯仿 | 2 % | 0.1 % | Pass |
十二烷基硫酸钠(SDS) | 0.2 % | 0.01 % | Pass |
Triton X-100 | 0.2 % | 0.01 % | Pass |
牛血清白蛋白(BSA) | 200 mg/mL | 10 mg/mL | Pass* |
dNTPs** | 2 mM | 100 μM | Pass |
聚乙二醇 | 40 % | 2 % | Pass |
琼脂糖 | 2 % | 0.1 % | Pass |
【注】:3份dsDNA平行样品的标准曲线,分别在上述含有特定浓度污染物的条件下(初始浓度进行检测,“Pass”指与没有污染物的体系相比较,实验结果变化范围<20%。所有样品用Molecular DevicesGemini XS酶标仪在485 nm处激发,在530 nm处测荧光强度。“Pass *”指由此条件测得的标准曲线有少许变动。“dNTPs**”指dATP, dCTP, dGTP, dTTP的混合物。