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产品描述
Evagreen 是一种用于实时定量PCR（qPCR）的DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于SYBR Green I。除了有相似的光谱特性，Evagreen有三个主要特点使它区别于SYBR Green I 。
首先，Evagreen对PCR的抑制性远小于SYBR Green I。因此，使用Evagreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，Evagreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBR Green I扩增信号。较高浓度的Evagreen也消除了“染料重分布”的缺陷，使Evagreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM）。该分析正被越来越多的用于PCR后的基因分型和异源双链分析。由于SYBR Green I对PCR的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此SYBR Green I无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同时，染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性，因为低熔点的DNA链可能由于这种原因而无法检测到。
第二，Evagreen的稳定性强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBR Green I不稳定而且降解后对PCR抑制性更强。
第三，Evagreen降低了细胞膜透性，因而比SYBR Green 1更加安全。独立实验室的测试结果显示，Evagreen既没有诱变性也没有细胞毒性。相反，虽然SYBR Green I本身诱变性很弱，但它在细胞中可能抑制了正常DNA的修复机制，使其有诱变增强作用。考虑到PCR的广泛使用，其安全性应该足够重视。
订购信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| Evagreen (20 × in water) | AN19L032 | 1 mL |
| Evagreen (20 × in water) | AN19L033 | 5 mL |
产品参数
λabs/λem = 500/530 nm (结合DNA)
λabs = 471 nm (未结合DNA)
运输与保存
蓝冰运输。4℃短期避光保存，有效期12个月；-20℃长期避光保存，有效期24个月。
使用方法
如下建立实验体系：（仅供参考）
| 名 称 | 体 积 |
| 10× 的无Mg2＋聚合酶缓冲液 | 5 µL |
| 50 mM MgCl2 | 2.5 µL |
| 2 mM dNTP | 5 µL |
| 20×Evagreen | 2.5 µL |
| Taq DNA polymerase | 1-5 units |
| F, R Primers | 各0.1-0.5 µM |
| 模板 | 适量 |
| dH2O | to a final volume of 50 µL |
实验目的
实时定量PCR检测20× Evagreen
主要试剂
1. Prime
hβ-actin：
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)
实验方案
1. 配制2× Evagreen Buffer
| 2× Evagreen Buffer | ||
| 组分 | 浓度 | 体积（μL） |
| 1 M Tris HCl pH8.5 | 50 mM | 5 |
| 500 mM (NH4)2SO4 | 20 mM | 4 |
| 50 mM MgCl2 | 7 mM | 14 |
| 50% glycerol | 2.5% | 5 |
| DMSO | 10 % | 10 |
| 20× Evagreen | 2× | 10 |
| 10 mM dNTPs | 0.4 mM | 4 |
| 2 % Tween20 | 0.03 % | 1.5 |
| 1 mg/mL BSA | 22 ug/mL | 2.2 |
| H2O | / | 44.3 |
| Total volume | / | 100 |
2. 配制 q-PCR反应体系
| 成分 | 20 μL/体系/管反应 |
| 10 μM primers | 1 μL |
| 模板 | 适量 |
| HS Taq DNA 酶 （5 U/μL） | 0.2 μL |
| 2× Evagreen buffer | 10 μL |
| H2O | 定容至20 μL |
【注】：① DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。②引物终浓度一般控制在0.1-0.5 μM范围内。
3. 实验分组：标准对照样品孔（阳性对照）、检测样品孔、空白对照孔（阴性对照）共三组，同时进行检测，分别进行三次平行实验。
4. 混匀离心、上机进行荧光定量PCR（仪器为Roche：LC96）。
PCR程序：
| 温度 | 时间 | |
| Step 1 | 95℃ | 2 min |
| Step 2 | 95℃ | 5 sec |
| Step 3 | 60℃ | 30 sec |
| Step 2~3，重复 45个循环 | ||
| 熔解曲线Tm值 57℃~99℃ | ||
5. 保存数据，判断样本质量：
A．检测样品与标准品之间的Ct值差
B．检测样品与标准品之间的荧光强度差
检测结果需达到：以上两组检测指标无显著性差异
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
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公司简介
李记生物-专注高效转染试剂
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上海李记生物成立于2015年，坐落于大美浦东。是集研发、生产、销售为一体的国产生物试剂公司，目前拥有多名复旦、交大、同济博士的研发团队，和一支年轻、专业敢拼的销售团队，以及在全国40余座城市铺设多名授权代理商体系。
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