工作原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）检测原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）检测用于测量在 Tyr705 位点磷酸化的 STAT3。与蛋白质印迹法不同，该检测基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜。磷酸化 STAT3（Tyr705）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体。第一种抗体因其对蛋白质上磷酸化基序的特异性结合而被选择，第二种抗体因其能够识别不依赖于其磷酸化状态的蛋白质的能力而被选择。蛋白质磷酸化使得涉及两种标记抗体的免疫复合物形成，这使供体荧光团与受体紧密接近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。其强度与样品中存在的磷酸化蛋白的浓度直接成正比，并在无需洗涤的检测形式下提供了一种评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 STAT3（Tyr705）双板检测方案：
双板方案涉及在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔低体积检测板中，之后加入磷酸化 STAT3（Tyr705）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和融合度。

磷酸化 STAT3（Tyr705）单板检测方案：
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT3（Tyr705）可以在一个用于培养、刺激和裂解的单板上进行。无需洗涤步骤。这个为高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持强大的 HTRF 质量。

检测验证：
使用磷酸化 STAT3 检测进行 HTRF 与蛋白质印迹法的比较：
HeLa 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% 二氧化碳的条件下培养 2 天。用 5nM 的 IFNα 刺激 15 分钟。移除细胞培养基，向细胞中加入 3ml 裂解缓冲液，然后孵育 45 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物对蛋白质印迹法和 HTRF 进行并行比较。这两种方法显示出相当的灵敏度水平：750 个细胞。HTRF 比蛋白质印迹法具有更高的便利性。

在 NIH 3T3 细胞上的 IL6 剂量反应：
小鼠 NIH 3T3 细胞（每孔 100,000 个细胞）在 37°C 下用各种浓度的 IL6 刺激 30 分钟。经过 30 分钟的裂解孵育时间后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）细胞检测试剂盒的双板检测方案测量磷酸化的 STAT3。

JAK 抑制剂对 HeLa 细胞的抑制作用：
HeLa 细胞（每孔 100,000 个细胞）在 37°C 下用各种浓度的拮抗剂孵育 1 小时。然后加入激动剂（IFNα）并孵育 30 分钟。经过 30 分钟的裂解孵育时间后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）细胞检测试剂盒的双板检测方案测量磷酸化的 STAT3。

用 HTRF 总 STAT3 检测来检查 STAT3 的磷酸化状态：
使用磷酸化 STAT3（Tyr705）和总 STAT3 检测的双板检测方案，用 IFNα 激活 HeLa 细胞（每孔 100,000 个细胞）15 分钟。获得的结果显示在 IFNα 刺激下 STAT3 磷酸化呈剂量反应性增加，而 STAT3 的表达水平保持恒定。

简化的通路：
STAT3 在细胞因子受体信号通路中的作用：
响应细胞因子和生长因子，STAT3 被受体相关激酶磷酸化，然后形成二聚体转移到细胞核，在那里它们作为转录激活因子起作用。STAT3 响应细胞刺激介导多种基因的表达，因此在许多细胞过程中如细胞生长和凋亡中起着关键作用。白细胞介素 6 家族细胞因子与 gp130 受体的结合通过 JAK2 触发 STAT3 磷酸化。STAT3 也是其他受体如受体酪·激酶（EGFR、cmet.）和 c-src 的靶标。