检测原理：在 HTRF 相互作用检测中，一部分（直接或间接）用供体标记，另一部分用受体标记（同样直接或间接）。信号强度与两部分的结合成正比。在此处所示的例子中：单克隆抗体 Anti-6HIS Tb Gold 与带 6 个标签的A部分 结合，而 B部分 * 与用 HTRF 受体标记的特异性抗体结合。*  B部分 也可以是化的、带标签的、Fc 融合的。在这些情况下，使用相应的用受体标记的 HTRF 试剂（抗标签、抗物种、蛋白 A、链霉亲和素）进行检测。

检测方案：右侧的例子描述了使用 20µL 最终检测体积来检测带 6 个标签的A部分 和未带标签的 B部分* 之间相互作用的方案。分配两个部分（10µL），孵育，加入单克隆抗体 Anti-6HIS Tb Gold（5µL）和用受体标记的抗B部分（5µL），孵育并读取。* B部分也可以是化的、带标签的、Fc 融合的或直接标记的。在这些情况下，使用相应的用受体标记的 HTRF 试剂（抗标签、抗物种、蛋白 A、链霉亲和素）进行检测。

检测细节：

1. 测试次数与活性部分的关系：每孔的平均结合物数量反映了总体生物材料含量。通常优选使用活性部分的量而不是总结合物的量。对于穴状化合物和 d2 结合物，总结合物的量等于活性部分的量，因为标记的分子量可以忽略不计。对于用 XL665 标记的实体，总结合物的量将根据 XL665 结合物的最终摩尔比而变化，然而，Revvity 提供的活性部分的量是恒定的，并且基于订购的测试次数。

2. 推荐的穴状化合物和 XL665 结合物的量：穴状化合物结合物不能过量，以防止读数器饱和和不可接受的背景水平。在大多数情况下，1 到 5nM 的穴状化合物浓度是合适的，并且根据所使用的与 HTRF 兼容的读数器，在 620nm 处将产生 20,000 到 80,000 cps。XL665 结合物必须尽可能与其检测对应物匹配，以便最大数量的生物分子被 XL665 受体标记。因此，要检测浓度为 20nM 的带标签分子，抗标签 - XL665 的浓度应是等摩尔或更高。

检测验证：

铕与铽抗体用于鉴定分子相互作用：根据标签位置的不同，检测性能可能因蛋白而异。这里描述了不同的 Revvity 抗 6His 结合物（铕、铽、铕 Gold、铽 Gold）和 Lanthascreen 抗 His 标签抗体（铕、铽）的并行使用。这些情况表明，根据所研究的相互作用，可能需要使用不同的抗体：在一种情况下，基于铕的抗体表现良好，而在另一种情况下，铽显示出更好的结果。对于下面测试的每个相互作用，Revvity Anti 6His Gold 结合物的性能优于 Lanthascreen Anti-6His 标签抗体。

BRD4 (1)-H4 肽相互作用的检测原理：带 6 个标签的 BRD4 (1) 阅读结构域与化肽底物 H4 的结合通过结合物混合物检测：针对 6His 标签的供体穴状化合物标记抗体和用于检测化肽的 SA-XL665。

确定最佳 H4 肽浓度：肽滴定的第一步显示，使用 Lanthascreen 铕或铽抗体供体时无法检测到（铽标记的数据未显示）。对于这些，不能考虑进一步的化合物筛选。然而，Revvity 的 Gold 版本和经典版本的抗 6His 抗体都能够检测到相互作用。使用 Gold 版本增加了检测窗口。

JQ1 对 BRD4-H4 相互作用的抑制作用：JQ1 抑制剂的 IC50 在 12 到 24.5nM 之间，与文献一致。正如预期的那样，新的 Anti-6His 穴状化合物 Gold 显示出增加的检测窗口。

NEFcore/Hck (SH3 结构域) 蛋白质 - 蛋白质相互作用的检测原理：NEFcore HcK SH3 结构域相互作用是 HIV 传染病的一个重要目标。这种相互作用的抑制剂是重要的目标，并被认为是治疗解决方案。带有 GST 标签的 NEFcore 使用 Revvity PPI MAb Anti GST-d2 抗体在 3nM 下检测。含有 6His 标签的 HcK SH3 结构域使用 Anti 6His Gold 供体结合物检测。

确定最佳 GST-Nef 浓度：当使用 Revvity Anti-6His Tb 穴状化合物时无法检测到（使用铕时观察到相同的结果，数据未显示），Gold 版本显示出检测窗口的显著增加，使得能够进一步筛选这种蛋白质 - 蛋白质相互作用。结果优于使用 Lanthascreen Tb 抗 His 标签抗体获得的结果（对于铕也是相同的结论，数据未显示）。

FynSH3 对 NEFcore/Hck (SH3 结构域) 相互作用的抑制作用：使用 FynSH3 蛋白进行抑制剂筛选测定，它与 Nef Core 结构域结合，与 HcK SH3 结构域竞争。这显示出 IC50 为 0.7 - 2µM。使用 Revvity Anti-6His Tb 穴状化合物时检测窗口略好。