乙酰辅酶羧化酶（ACC）活性检测试剂盒（酶法）说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC6020

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1．提取液二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。

2．提取液的配制：按提取液一：提取液二=990μL：10μL（共1mL，约1T）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一中。

3．试剂一：临用前将试剂一B全部倒入试剂一A，充分溶解待用；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融。

4．试剂二：试剂放于棕色瓶内玻璃瓶中，临用前加入12mL蒸馏水，充分溶解待用；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融。

5．试剂三稀释液：临用前离心，根据样本量按照试剂三：蒸馏水=1μL：50μL（共51μL，约1T）的比例充分混匀，现配现用。

6．试剂四稀释液：临用前离心，根据样本量按照试剂四：蒸馏水=4μL：500μL（共504μL，约10T）的比例充分混匀，现配现用。

7．试剂五：试剂放于棕色瓶内玻璃瓶中，临用前加入12mL蒸馏水；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融。

8．试剂六：试剂放于棕色瓶内玻璃瓶中，临用前加入12mL蒸馏水；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融。

9．工作液的配制：临用前根据样本量按试剂三稀释液：试剂四稀释液：试剂五：试剂六=50μL:50μL:200μL:200μL（共500μL，约1T）的比例配制，现配现用。

产品说明：

乙酰辅酶羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶羧化生成丙二酰辅酶，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC能够催化乙酰辅酶、NaHCO₃和ATP生成丙二酰辅酶、ADP和无机磷，丙 酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一

步依次催化NADH生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映ACC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、分析天平、低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、漩涡震荡仪、水浴锅/恒温培养箱、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

2、细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3、血清（浆）：直接测定。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 临用前根据样本量将试剂一和工作液预热5min。

3、 操作表：(在1mL石英比色皿/1.5mL离心管中依次加入下列试剂)

三、ACC活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD⁺为一个酶活单位。

ACC活性（U/mg prot）=[∆A×V反总÷（ɛ×d）×10⁹]÷（Cpr×V样）÷T=321.5×∆A÷Cpr

2. 按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD⁺为一个酶活单位。

ACC酶活（U/g 质量）=[∆A×V反总÷（ɛ×d）×10⁹]÷（W×V样÷V样总）÷T=321.5×∆A÷W

3. 按照细菌或细胞数量计算：

酶活定义：每10⁶个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD⁺为一个酶活单位。

ACC酶活（U/10⁶ cell）=[∆A×V反总÷（ɛ×d）×10⁹]÷（N×V样÷V样总）÷T =321.5×∆A÷N

4. 按血清（浆）体积计算：

酶活定义：每mL液体在反应体系中每分钟催化1nmol NADH转化为1nmol NAD⁺为一个酶活单位。

ACC酶活（U/mL）=[∆A×V反总÷（ɛ×d）×10⁹]÷V样÷T=321.5×∆A

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ɛ：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；N：细菌或细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅

中，在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3、 当A1测定空白时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定；当样本∆A过小时，建议增大样本量或延长反应时间，注意同步修改计算公式。

4、 由于提取液一中含有蛋白（约1mg/mL），若需要测定样本的蛋白浓度，需要减去提取液本身的蛋白浓度。

实验实例：

1. 取0.1044g小鼠脑组织，加入1mL提取液，进行匀浆、离心、取上清，之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA=（A1测定-A2测定）-（A1空白-A2空白）=（1.520-0.229）-（1.489-1.456）=1.258，按样本质量计算酶活得：

ACC酶活（U/g 质量）=321.5×∆A÷W=3874.01 U/g 质量。

2. 取0.1041g向日葵叶片组织，加入1mL提取液，进行匀浆、离心、取上清，之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA=（A1测定-A2测定）-（A1空白-A2空白）=（1.477-1.374）-（1.489-1.456）=0.070，按样本质量计算酶活得：

ACC酶活（U/g 质量）=321.5×∆A÷W=216.19 U/g 质量。

3. 取3×10⁶个Raw细胞，加入1mL提取液，进行匀浆、离心、取上清，之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA=（A1测定-A2测定）-（A1空白-A2空白）=（1.464-1.255）-（1.489-1.456）=0.176，按细胞数量计算酶活得：

ACC酶活（U/10⁶ cell）=321.5×∆A÷N=18.86 U/10⁶ cell。

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