糖原合成酶（GCS）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC3335

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂四：用前取1支加入1.5 mL试剂一充分溶解，-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂五：用前取1支加入1.5 mL试剂一充分溶解，-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 工作液的配制：临用前将试剂三离心，取10 μL试剂三，加7 mL试剂一、1.5 mL试剂四、1.5.mL试剂五，充分混合（约66T），现用现配，也可根据样本量按比例配制；

4、 试剂八的配制：

（1） 临用前取1瓶试剂八加入2.5 mL试剂二溶解，再加入1支试剂七溶解，可-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

（2） 用前试剂六先离心，取14 μL试剂六加入1.46mL上述（1）中溶液，充分混合（约36T），现用现配，也可根据样本量按比例配制。

产品说明：

糖原合成酶（Glycogen synthase , GCS）将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端，以α-1,4糖苷键连接。GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶，同时也是胰岛素作用的主要靶酶，在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。

GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD⁺，在340 nm下测定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、超声破碎仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（10⁴个）:提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率200w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清等液体：直接检测。（若溶液浑浊则离心后取上清进行测定）

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2、 临用前将工作液与试剂八置于37℃水浴锅中预热5min（工作液用多少预热多少）。

3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂：

三、GCS酶活计算

A、按微量石英比色皿计算：

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCS酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T=3215.4×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCS酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×W÷V样总）÷T =3215.4×ΔA÷W

3. 按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCS酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T

=3215.4×ΔA÷细胞数量（万个）

4. 按液体体积计算

酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCS酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T =3215.4×ΔA

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；V

反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间：1min。

B、按96孔UV板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。

实验实例：

1、 取0.1g小鼠心脏加入1mL提取液进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.2455-1.1883=0.0572，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9639-0.9529=0.011，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0572-0.011=0.0462，按照样本质量计算酶活得：

GCS酶活（U/g 质量）=3215.4×ΔA÷W=1485.5 U/g 质量。

注意事项：

1、 样本提取上清液置于冰上待测，提取样本建议当天测完。

2、 若ΔA大于0.2，建议将样本用提取液稀释适当倍数后测定，以提高检测灵敏度，并在计算公式中乘以相应的稀释倍数。

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