糖原磷酸化酶b（GPb）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC3350

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入1.25 mL蒸馏水，充分混匀；2-8℃保存2个月；

2、 试剂三：临用前加入1.25 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入1.25mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

4、 试剂五：临用前每支加入1 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

5、 试剂六：临用前每支加入1 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

6、 试剂七：临用前加入4 mL蒸馏水，充分混匀后-20分装保存4周，避免反复冻融；

7、 工作液的配制：临用前根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四 =740μL: 20μL: 20μL: 20μL（1T的量）的比例，充分混匀，现用现配。

产品说明：

糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a, GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b, GPb）两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶a的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶a催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。添加激活剂测定GP（GPa和GPb）总活性，未添加激活剂时测定GPa活性，GP活性-GPa活性得到GPb活性。在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映糖原磷酸化酶a活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、电子天平、可调式移液器、研钵/匀浆器、1 mL石英比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

2、血清（浆）：直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。

3、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2、 工作液置于37℃预热5min。

3、 GPa活性：在石英比色皿中依次加入50 μL样本、50 μL试剂五、50 μL试剂六、50 μL蒸馏水、800 μL工作液，立即混匀并计时，记录340nm处10s时吸光值A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应10min，反应后拿出迅速擦干测定10min10s时吸光值A2。计算ΔAGPa=A2-A1。

4、 GP活性：在石英比色皿中依次加入50 μL样本、50 μL试剂五、50 μL试剂六、50 μL试剂七、800 μL工作液，立即混匀并计时，记录340nm处10s时吸光值A3，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应10min，反应后拿出迅速擦干测定10min10s时吸光值A4计算ΔAGP=A4-A3。

三、 糖原磷酸化酶b (GPb)活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（U/mg prot）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（U/g 质量）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷W

3. 按样本体积计算

单位定义：每mL液体每分钟产生1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位

GPa（U/mL）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷V样÷T=321.54× (ΔA_GP-ΔA_GPa)

4. 按细胞数量计算

单位定义：每1万个细胞每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPa（U/10⁴ cell）=[(ΔA_GP-ΔA_GPa) ×V反总÷(ε×d)×10⁹] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa)÷细胞数量

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计；10⁹：1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、如果测定吸光值ΔA＞0.8，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白OD值，建议增加反应中的样本体积或者样本质量后再进行测定。

实验实例：

1、 称取0.1 g兔子肝脏组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。按照测定步骤操作，用石英比色皿比色后计算ΔA_GPa=A2-A1=0.414-0.318=0.096，ΔA_GP=A4-A3= 0.434-0.320 =0.114,按公式计算活性：

GPb（U/g 质量）=321.54×(ΔA_GP-ΔA_GPa) ÷W =321.54×(0.114-0.096)÷0.1 =57.87U/g 质量

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