焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC3400

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加6 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存两周，禁止反复冻融。

2、 试剂三：临用前加6 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存两周，禁止反复冻融。

3、 试剂四：临用前取1支加入0.3 mL蒸馏水溶解备用，2-8℃保存一周。

4、 试剂五：临用前取1支加入0.3 mL蒸馏水溶解备用，-20℃分装保存一周，禁止反复冻融。

5、 试剂六：临用前加入0.6 mL蒸馏水溶解备用，2-8℃保存一周，也可按比例现用现配。

产品说明：

焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一种胞质酶，广泛存在于植物组织中，与磷酸果糖激酶一样催化果糖-6-磷酸的磷酸化，单PEP催化反应为可逆反应，并以焦磷酸代替ATP，在光合作用碳代谢中起重要作用。

PFP催化6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖，它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为磷酸二羟丙 酮，再由α-磷酸甘油脱氢酶和NADH 催化生成3-二磷酸甘油和NAD，340nm处的吸光度变化反映了PFP的活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1 mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，20000 g离心15 min，取上清置冰上待测；

2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min）；然后4℃，20000 g离心15 min，取上清置冰上待测；

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。  

2、 操作表：

三、焦磷酸：果糖6-磷酸-1磷酸转移酶活性的计算

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(W×V样÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样×细胞数量÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T=53.59×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V提取：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10⁹：换算系数，1mol=10⁹ nmol。

注意事项：

1、每次检测样本数不宜太多以免耽误过多的酶促反应时间。

实验实例：

1、取0.1g豆芽进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算 A1测定管-A2测定管=1.041-0.963=0.078、A1空白管-A2空白管=0、ΔA=（A1测定管-A2测定管）-（A1空白管-A2空白管）=0.078，按照样本质量计算酶活得：

PFP（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(W ×V样÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W=41.8 U/g 质量。

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