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3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号: BC2210
规格: 25T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体30 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 试剂一 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
| 试剂二 | 液体25 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 试剂三 | 液体15 µL×1瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
试剂三：液体置于试剂瓶内EP管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为3:100的体积比例充分混匀，现用现配。
工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
产品说明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、无机磷和NAD+，340nm处测定NADH的减少量可反映GAPDH活性的高低。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：
| 试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
| 样本（µL） | 30 | |
| 蒸馏水（µL） | 30 | |
| 试剂三（µL） | 20 | 20 |
| 工作液（µL） | 950 | 950 |
| 在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5min，拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2，计算ΔA测定管= A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次） | ||
三、GAPDH酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算
酶活定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=1072×ΔA÷W
3、按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T=2.14×ΔA
4、按照血清（浆）体积计算
酶活定义：每mL样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GAPDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷V样÷T= 1072×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V样：反应体系中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：5min；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
当A1小于0.8或ΔA大于0.7时，建议将样本稀释后再进行测定。
空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。
实验实例：
取0.1g兔肾脏加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.815-0.158=0.657，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.656，按样本质量计算酶活得：GAPDH酶活（U/g质量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g质量。
取0.1g三叶草加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心20min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.026-1.017=0.009，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.008，按样本质量计算酶活得：GAPDH酶活（U/g质量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g质量。
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