谷*甘肽还原酶（GR）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1165
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水溶解备用，2-8℃可保存4周；

2. 试剂三：试剂存于试剂瓶内玻璃瓶中；临用前加入3 mL蒸馏水溶解备用，-20℃可分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：
GR（EC1.8.1.7，Glutathione Reductase，GR）是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR是 谷*甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原*生成GSH，有助于维持体内GSH/*比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－ 谷*甘肽循环途径。
GR能催化NADPH还原*再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP⁺；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP⁺在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、移液器、匀浆器/研钵/细胞超声破碎仪、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。

2. 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（血浆）等液体：直接测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计或酶标仪预热30 min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2. 根据样本量取部分试剂一置于37℃中预热15min以上。

3. 操作表：（在微量石英比色皿或96孔UV板中加入下列试剂）

三、GR活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：在37℃，pH 8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/mg prot)= [ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷（Cpr×V样）÷T
=0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：在37℃，pH 8.0条件下，每克样本每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/g 质量)= [ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶] ÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在37℃，pH 8.0条件下，每10⁴个细胞每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活单位。
GST活性（U/10⁴ cell）=[ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反总]÷(N×V样÷V样总)÷T
    =0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷N
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在37℃，pH 8.0条件下，每毫升液体每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活单位。
GST活性（U/mL）= [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反总]÷V样÷T
= 0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)
ε：NADPH摩尔消光系数6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；10⁶：单位换算系数，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中的样本体积，20μL=2×10^-2mL；V样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，3min；N：细胞数量，以万计。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在37℃、pH 8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/mg prot)=[ (ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷（Cpr×V样）÷T
   =0.893×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算
活性单位定义：在37℃、pH 8.0条件下，每克样本每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/g质量)=[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T
          =0.893×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W
（3）按细胞数量计算：
活性单位定义：在37℃、pH 8.0条件下，每10⁴个细胞每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活单位。
GST活性（U/10⁴ cell）=[ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反总]÷(N×V样÷V样总)÷T
    =0.893×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷N
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在37℃、pH 8.0条件下，每毫升液体每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活单位。
GST活性（U/mL）= [(ΔA测定管-ΔA空白管)÷（ε×d）×10⁶×V反总]÷V样÷T
= 0.893×(ΔA测定管-ΔA空白管)
ε：NADPH摩尔消光系数6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；10⁶：单位换算系数，1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中的样本体积，20μL =2×10^-2mL；V样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，3min；N：细胞数量，以万计。
注意事项：

1. 样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

2. 测定前须先用1-2个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2-5倍；

3. 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约0.1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去试剂一本身的蛋白含量。

实验实例：

1. 取0.1g桃树叶片加入1.0 mL试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清液稀释4倍后按测定步骤检测，用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A测1-A测2=1.0765-0.626=0.4505，ΔA空白管=A空1-A空2=0，按样本质量计算酶活得：

GR酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W×4（稀释倍数）=9.66 U/g 质量。

1. 取0.1g大鼠肝脏组织加入1.0 mL试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清液稀释8倍后按测定步骤检测，用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A测1-A测2=0.9916-0.5632=0.4284，ΔA空白管=A空1-A空2=0，按样本质量计算酶活得：

GR酶活(U/g 质量)=0.536×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W×8（稀释倍数）=18.37 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Hua Li,Lanying Wang,Yanping Luo. Composition Analysis by UPLC-PDA-ESI (−)-HRMS and Antioxidant Activity Using Saccharomyces cerevisiae Model of Herbal Teas and Green Teas from Hainan. Molecules. October 2018;(IF3.06)

2. Zeyong Zhang,Huanhuan Liu,Ce Sun,et al. A C2H2 zinc-finger protein OsZFP213 interacts with OsMAPK3 to enhance salt tolerance in rice. Journal of Plant Physiology.October 2018;(IF2.825)

3. Li S, Tian Y, Wu K, et al. Modulating plant growth–metabolism coordination for sustainable agriculture[J]. Nature, 2018, 560(7720)：595-600.

参考文献：

1. Demiral T, Türkan I. Comparative lipid peroxidation, antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice culti vars differing in salt tolerance[J]. Environmental and experimental botany, 2005, 53(3): 247-257.

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