辅酶 II NADP(H)含量检测试剂盒说明书（WST显色法）

可见分光光度法

货号：BC5200

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入12mL蒸馏水充分混匀，溶解后2-8℃保存4周。

2、 试剂四：临用前将试剂四A溶解到试剂四B中，分装保存，避免反复冻融，-20℃保存4周。

1、 NADP标准品：临用前加入 1.27 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

2、 NADPH标准品：临用前加入 1.2 mL 蒸馏水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

产品说明：

辅酶Ⅱ NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP⁺和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP⁺)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP⁺比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP⁺和NADPH。在1-mPMS作用下，WST-1可与NADPH反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH，进一步采用WST-1检测。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅，研钵/匀浆器、超声破碎仪，可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：取血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1:5-10的比例，（建议取0.1mL血清（血浆），加入0.5 mL酸性提取液），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADPH的提取：取血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1:5-10的比例，（建议取0.1mL血清（血浆），加入0.5 mL碱性提取液），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

2、组织中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：建议取0.1g组织质量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADPH的提取：建议取0.1 g组织质量，加入0.5 mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

3、细胞或细菌中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，离心弃上清，建议500万细胞或者细菌加入0.5mL酸性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30次），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

NADPH的提取：建议500万细胞或者细菌加入0.5mL碱性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30次），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 NADP⁺标准品：用蒸馏水稀释为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0nmol/mL的标准溶液（0nmol/mL即空白管）。

3、 NADPH标准品：用蒸馏水稀释为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0nmol/mL的标准溶液（0nmol/mL即空白管）。

4、 稀释表（附于说明书最后）

5、 在EP管中按顺序加入下列试剂：

混匀，450nm下比色，读取吸光值，NADP⁺的记为：ΔA _NADP+= A₂- A₁，NADPH的记为ΔA_NADPH= A₂’- A₁’，NADP标准管的记为ΔA _NADP标= A_标-A_空白管。NADPH标准管的记为ΔA _NADPH标= A_标’-A_空白管。（标准曲线只需做1-2次，每个测定管需设一个对照管）。

三、NADP⁺和NADPH含量计算

1、标准曲线绘制：

（1） NADP⁺标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₁，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADPH标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₂，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA´代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NADP⁺和NADPH含量计算

（一）NADP⁺含量计算

（1） 按液体体积计算：NADP⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADP⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算NADP⁺含量(nmol/g 质量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按细胞数量计算：NADP⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADPH含量计算

（1） 按液体体积计算：NADPH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADPH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算NADPH含量(nmol/g 质量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按细胞数量计算：NADPH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液体积，1mL；V血清：血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样

本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三按比例配成混合液。

2、反应过程中注意避光。

3、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒50管可以测定24个NADP⁺或NADPH。

4、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。同步修改计算公式。

实验实例：

1. NADP⁺的测定：称取 0.1g冬青叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.052-0.036=0.016，标准曲线y₁=0.333x-0.0063,根据标曲得出x₁=0.067，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=0.67 nmol/g 质量。

NADPH的测定：称取 0.1g 冬青叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.153-0.096=0.057，标准曲线y₂=0.0914x-0.0065,根据标曲得出x₂=0.695，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 质量）= x₂÷W=6.947 nmol/g 质量。

2. NADP⁺的测定：称取 0.1g 小鼠肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.042-0.028=0.014，标准曲线y₁=0.333x-0.0063,根据标曲得出x₁=0.061，NADP⁺含量得：NADP⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=0.61nmol/g 质量。

NADPH的测定：称取 0.1g 小鼠肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.19-0.063=0.127，标准曲线y₂=0.0914x-0.0065,根据标曲得出x₂=1.461，NADPH含量得：NADPH (nmol/g 质量）= x₂÷W=14.61 nmol/g 质量。

3. NADP⁺的测定：取0.1mL牛血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.048-0.030=0.018，标准曲线y₁=0.333x-0.0063,根据标曲得出x₁=0.073，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/mL）= 11×x₁=0.803 nmol/mL。

NADPH的测定：取0.1mL牛血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.056-0.032=0.024，标准曲线y₂=0.0914x-0.0065,根据标曲得出x₂=0.334，NADPH含量得：NADPH (nmol/mL）= 11×x₂=3.671 nmol/mL。

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