NADP磷酸酶（NADPase）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号: BC1110
规格: 50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：用时加入1.5 mL试剂一充分溶解备用，现配现用。

2. 试剂三：用时加入20 mL双蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

3. 试剂四：用时加入20 mL双蒸水，溶解后2-8℃可保存一周。

4. 标准品：10 mmol/L 标准磷贮备液。将标准品20倍稀释，即取 0.5 mL标准液加9.5 mL蒸馏水，充分混匀，配制成0.5 μmol/mL标准磷应用液。

5. 定磷试剂的配制：按H₂O：试剂三：试剂四：试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷试剂根据实验用量现用现配。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
产品说明：
NADPase主要存在于植物组织中，是生物体内催化NADP⁺降解为NAD⁺的酶，与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。
NADPase能够催化NADP⁺水解为NAD⁺和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿、匀浆器/研钵和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件

注意事项：

1. 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1. 取0.1肝加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.410-0.385=0.025，ΔA标准=A标准-A空白=0.365-0.005=0.360，按样本质量计算酶活得：NADPase (U/g质量)=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W=0.125×0.025÷0.360÷0.1=0.087 U/g质量。

2. 取0.1g狗尾巴草（块根)加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.510-0.107=0.403，ΔA标准=A标准-A空白=0.365-0.005=0.360，按样本质量计算酶活得：NADPase (U/g质量) =0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W=0.125×0.403÷0.360÷0.1=1.399 U/g质量。

参考文献：

1. Kawai S, Mori S, Mukai T, et al. Cytosolic NADP phosphatases I and II from Arthrobacter sp. strain KM: implication in regulation of NAD⁺/NADP⁺ balance[J]. Journal of Basic Microbiology: An International Journal on Biochemistry, Physiology, Genetics, Morphology, and Ecology of Microorganisms, 2004, 44(3): 185-196.

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