髓过氧化物酶（MPO）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5710

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取一瓶试剂二加入15mL试剂一，可37℃加热促进溶解，2-8℃可保存2周；

2. 试剂三：低温下试剂会出现析出凝固现象，临用前需37℃加热至澄清透明状态；

3. 工作液：临用前根据样本量按照试剂一：试剂四：试剂五=5.28mL：220μL：5.5μL（5.5mL，6S）的比例配制，现用现配。

产品说明：

髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）是一种由活化的中性粒细胞、单核-巨噬细胞分泌的白细胞酶，主要存在于中性粒细胞和单核-巨噬细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。当白细胞被激活后，MPO释放到吞噬泡和血浆，在特定条件下诱导氧化应激和组织损伤，是系统炎症和氧化应激的标志物。

MPO催化H₂O₂分解，同时将邻联茴香胺氧化生成有色物质，在460nm处有特征吸收峰，颜色深浅与MPO活性成线性关系。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按质量（g）：试剂二体积（mL）=1：5~10比例加入试剂二（建议称取0.1g样本，加入1.0mL试剂二），冰浴匀浆后，于4℃，12000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细胞样本：按细胞数量（10⁶）：试剂二体积（mL）=5~10：1的比例加入试剂二（建议5×10⁶个细胞加入1.0mL试剂二），冰浴超声破碎细胞（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后于4℃，12000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 液体样本：按液体体积（mL）：试剂二体积（mL）=1：1的比例加入试剂二（相当于稀释2倍），混匀，于4℃，12000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。（若测定数值较小，可以调整比例进行前处理，例如2：1或3:1）

二、 测定步骤

1．可见分光光度计预热30min以上，调节波长至460nm，蒸馏水调零。

2．在2mL EP管按下表顺序加样：

三、MPO活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在37℃反应体系中每小时催化产生1μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活单位。

MPO活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样) ÷T=3.053×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织在37℃反应体系中每小时催化产生1μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活单位。

MPO活性（U/g 质量）=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W÷V提取×V样) ÷T= 3.053×ΔA÷W

3. 按细胞数目计算

单位的定义：每10⁶个细胞在37℃反应体系中每小时催化产生1μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活单位。

MPO活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷(ε×d)×V反总÷(N÷V提取×V样) ÷T= 3.053×ΔA÷N

4. 按液体体积计算

单位的定义：每mL液体在37℃反应体系中每小时催化产生1μmol氧化型邻联茴香胺定义为一个酶活单位。

MPO活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反总÷V样×F÷T=6.106×ΔA

ε：氧化型邻联茴香胺消光系数，11.3mL/μmol/cm；d：光径，1cm；V反总：反应总体积，1.035mL；V样：加入样本体积，0.06mL；V提取：组织/细胞样本处理时加入试剂二的体积，1mL；F：液体前处理稀释倍数，2；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数目，以10⁶计；T：酶促反应时间，30min=0.5h。

注意事项：

1. 建议每次实验前查看试剂二和试剂三是否澄清透明，若不澄清透明，需37℃加热至溶液澄清透明方可使用。

2. 如果∆A小于0.01或测定管吸光值接近对照管，可以增加样本量或者延长37℃酶促反应时间后再进行测定；如果∆A测定大于0.5或A测定大于1.5，建议将样本匀浆后的上清液用试剂二适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1029g小鼠肺脏样本，加入1mL试剂二进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA=A测定-A对照=0.367-0.045=0.322，按样本质量计算得：

MPO活性（U/g 质量）=3.053×ΔA÷W = 9.554 U/g 质量。

2. 取4×10⁶个KB细胞，加入1mL试剂二进行冰浴超声破碎，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA=A测定-A对照=0.050-0.000=0.050，按样本细胞数目计算得：

MPO活性（U/10⁶ cell）=3.053×ΔA÷N = 0.038 U/10⁶ cell。

3. 取0.5mL马血清样本，加入0.5mL试剂二，混匀，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA=A测定-A对照=0.099-0.002=0.097，按液体体积计算得：

MPO活性（U/mL）=6.106×ΔA = 0.592 U/mL。

参考文献：

[1] Bradley PP, Priebat DA, Christensen RD. et al. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker [J]. The Journal of Investigative Dermatology, 1982, 78(3): 206-209.

[2] Krawisz J E, Sharon P, Stenson W F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity [J]. Gastroenterology, 1984, 87(6): 1344-1350.

[3] Tatjana Momić, Zoran Vujčić, Vesna Vasić. Kinetics of inhibition of peroxidase activity of myeloperoxidase by quercetin [J]. International Journal of Chemical Kinetics, 2008, 40(7): 384-394.

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