超氧化物歧化酶（SOD）分型活性检测试剂盒（WST法）说明书

（测Cu-Zn、Mn、总SOD活性）

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操

货号：BC5250

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：使用前先使用掌上离心机离心至管底再吹打混匀；

2、 试剂二工作液：根据样本数量按试剂二：蒸馏水=5μL：395μL（共400μL，可做约4个Cu-Zn-SOD样本或2个Mn-SOD样本）的比例配制试剂二工作液，现用现配；

3、 试剂四工作液：根据样本量按试剂四：蒸馏水=20μL：180μL（共200μL，约4T）的比例配制试剂四工作液，现用现配。

产品说明：

SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，根据其辅基结合金属离子的不同，可分为铜锌SOD、锰SOD等类型，铜锌SOD主要位于细胞质，锰SOD主要位于线粒体。SOD催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄*呤及黄*呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O₂^-)，O₂^-可与WST-1反应生成水溶性黄色甲臜，后者在450nm处有吸收峰；SOD可清除O₂^-，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。样本经过处理后铜锌SOD活性不变，锰SOD活性丧失。通过测定总SOD活性和铜锌SOD活性，可计算得到锰SOD活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、漩涡混匀仪/振荡器、水浴锅/恒温培养箱、电子天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理

1. 总SOD活性测定

1) 细菌或培养细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）=500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一）超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取全部上清，部分用于测定总SOD活性。

2) 组织样本：按照组织质量（g）：提取液一体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液一）进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取全部上清，部分用于测定总SOD活性。

3) 血清（浆）样本：直接用于测定总SOD活性，若有浑浊可离心后取上清进行测定。

2. 铜锌SOD活性测定

1) 取上一步提取得到的上清，按照上清体积（mL）：提取液二体积（mL）=2:3的比例（建议取0.2mL上清加入0.3mL提取液二）混合，震荡混匀1min，4000g 4℃离心10min，取最上层的上清用于测定铜锌SOD活性，此上清即样本处理上清，上清中铜锌SOD活性不变，锰SOD活性丧失。

注：上清和提取液二混匀离心后分为3层，取最上层溶液测定即可。

2) 按照蒸馏水体积（mL）：提取液二体积（mL）=2:3的比例（建议取0.2mL蒸馏水加入0.3mL提取液二）混合，震荡混匀1min，4000g 4℃离心10min，取最上层的上清用于测定铜锌SOD活性的空白管，此上清即蒸馏水处理上清。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2. 测定前将试剂一、试剂三和试剂四工作液37℃保温5min以上。

3. 样本测定（在EP管中按顺序加入下列试剂）

充分混匀，37℃水浴锅/恒温培养箱反应30min后，置于1mL玻璃比色皿测定450nm下的吸光度，空白管1、空白管2、空白管3和空白管4只需做1-2次，每个样本测定管需设置一个对照管。

总SOD的记为A1测定、A1对照、A1空白、A2空白，计算ΔA1测定=A1测定-A1对照，ΔA1空白=A1空白-A2空白。

铜锌SOD的记为A2测定、A2对照、A3空白、A4空白，计算ΔA2测定=A2测定-A2对照，ΔA3空白=A3空白-A4空白。

三、 SOD活性计算

1、抑制百分率的计算：

总SOD抑制百分率=(ΔA1空白-ΔA1测定) ÷ΔA1空白×100%

铜锌SOD抑制百分率=(ΔA3空白-ΔA2测定) ÷ΔA3空白×100%

尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量，但需相应减少测定管和对照管中蒸馏水的体积。注意同步修改计算公式。

2、SOD酶活性单位：在上述黄*呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。

3、SOD酶活性计算：

（1）血清（浆）SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（2）组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

A 按样本蛋白浓度计算

SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷（1-抑制百分率）×V反总]÷（V样×Cpr）×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

B 按样本质量计算

SOD活性 (U/g 质量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反总]÷(W×V样÷V样总)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

C 按细菌或细胞数量计算

SOD活力 (U/10⁴ cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(500×V样÷V样总)×F

=0.0222×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（3） 锰SOD活性=总SOD活性-铜锌SOD活性

V反总：反应体系总体积，1mL；V样：加入反应体系中样本的体积，0.09mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万，F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 样本和试剂二工作液使用时在冰上放置。

2、 样本较多时，可按表格配制测定管工作液和对照管工作液（包含试剂一、（试剂二工作液）、试剂三、蒸馏水），试剂四工作液必须最后加入。

3、 本试剂盒可做24个锰-SOD样本或者48个铜锌-SOD样本。

实验实例：

1. 取0.1019g车前叶片加入1mL提取液一进行匀浆研磨，取上清稀释2倍，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿

测得计算ΔA1测定= A1测定-A1对照=0.3454-0.0887=0.2567，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.7898-0.0694 =0.7204，总SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=64.367%；取0.2mL稀释2倍的上清，加入0.3mL提取液二，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测得计算ΔA2测定= A2测定-A2对照=0.7646-0.0683=0.6963，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.2289-0.0580=1.1709，铜锌SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=40.533%，按样本质量计算酶活得：

总SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =393.896 U/g 质量

铜锌SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =148.628 U/g 质量

锰SOD活性（U/g 质量）=393.896-148.628 =245.268 U/g 质量

2. 取0.1104g兔脾脏加入1mL提取液一进行匀浆研磨，取上清稀释10倍，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测得计算ΔA1测定= A1测定-A1对照=0.3507-0.0699=0.2808，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.7898-0.0694=0.7204，总SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=61.022%；取0.2mL稀释10倍的上清，加入0.3mL提取液二，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测得计算ΔA2测定= A2测定-A2对照=0.7782-0.0543=0.7239，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.2289-0.0580=1.1709，铜锌SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=38.176%，按样本质量计算酶活得：

总SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =1575.453 U/g 质量

铜锌SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =621.404 U/g 质量

锰SOD活性（U/g 质量）=1575.453-621.404=954.049 U/g 质量

3. 取1000万细胞加入1mL提取液一进行前处理并按测定步骤操作，反应体系中样本量加倍，用玻璃比色皿测得计算ΔA1测定= A1测定-A1对照=0.3761-0.1271=0.2490，ΔA1空白=A1空白-A2空白=0.8318-0.0608=0.7710，总SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=67.704%；取0.2mL上清，加入0.3mL提取液二，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测得计算ΔA2测定= A2测定-A2对照=0.5994-0.0590=0.5404，ΔA3空白=A3空白-A4空白=1.0406-0.0545=0.9861，铜锌SOD抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=45.201%，修改计算公式后按细胞数量计算酶活得：

总SOD活性（U/10⁴ cell）=0.0056×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =0.012 U/10⁴ cell

铜锌SOD活性（U/10⁴ cell）=0.0056×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =0.005 U/10⁴ cell

锰SOD活性（U/10⁴ cell）=0.012-0.005=0.007 U/10⁴ cell

参考文献：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

[3] Cristiana, F, Elena, A. and Nina, Z. Superoxide Dismutase: Therapeutic Targets in SOD Related Pathology[J]. Health, 2014, 06(10):975-988.

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