超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-1法）说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5160

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：使用前先使用掌上离心机离心至管底再吹打混匀；

2、 试剂二工作液：根据样本数量按试剂二：蒸馏水=5μL：395μL（共400μL，约4S）的比例配制试剂二工作液，现用现配；

3、 试剂四工作液：根据样本量按试剂四：蒸馏水=20μL：180μL（共200μL，约4T）的比例配制试剂四工作液，现用现配。

产品说明：

SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄*呤及黄*呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O₂^-)，O₂^-可与WST-1反应生成水溶性黄色甲臜，后者在450nm处有吸收峰；SOD可清除O₂^-，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、电子天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）=500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）样本：直接检测。若有浑浊可离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2. 测定前将试剂一、试剂三和试剂四工作液37℃水浴5min以上。

3. 样本测定（在EP管中按顺序加入下列试剂）

充分混匀，37℃水浴30min后，置于1mL玻璃比色皿测定450nm下的吸光度，分别记为A测定、A对照、A1空白、A2空白，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA空白=A1空白-A2空白。（空白管1和空白管2各只需做1~2管，每个样本有一个对照管）

三、 SOD活性计算

1、抑制百分率的计算：

抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白× 100%

尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样本；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量，但需相应减少测定管和对照管中蒸馏水的体积。

2、SOD酶活性单位：在上述黄*呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。

3、SOD酶活性计算：

（1）血清（浆）SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F

（2）组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

A. 按样本蛋白浓度计算

SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷（1-抑制百分率）×V反总]÷（V样×Cpr）×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

B. 按样本质量计算

SOD活性 (U/g 质量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反总]÷(W×V样÷V样总)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

C. 按细菌或细胞数量计算

SOD活力 (U/10⁴ cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(N×V样÷V样总)×F

=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F

V反总：反应体系总体积，1mL；V样：加入反应体系中样本的体积，0.09mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌总数，以10⁴计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 样本和试剂二工作液使用时在冰上放置。

2、 样本较多时，可按表格配制测定管工作液和对照管工作液（包含试剂一、（试剂二工作液）、试剂三、蒸馏水），试剂四工作液必须最后加入。

实验实例：

1、 取0.1016g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释50倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.502-0.011=0.491，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=49.796%，按样本质量计算酶活得：

SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =5423.086 U/g 质量。

2、 取0.1024g绿萝叶片加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清稀释3倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.490-0.105=0.385，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=60.634%，按样本质量计算酶活得：

SOD活性（U/g 质量）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =501.338 U/g 质量。

3、 450×10⁴个Hela细胞，加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.523-0.027=0.496，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=49.284%，按细胞数量计算酶活得：

SOD活性（U/10⁴ cell）=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F =0.024 U/10⁴ cell。

4、 取225μL兔血清（相应减少蒸馏水用量）按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定= A测定-A对照=0.855-0.158=0.697，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定) ÷ΔA空白×100%=28.732%，按血清（浆）体积计算酶活得：

血清（浆）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×F=1.792 U/mL。

参考文献：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

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