SOLARBIO/索莱宝 品牌
生产厂家厂商性质
北京市所在地
组胺含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC5670
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2支 | 2-8℃保存 |
试剂二稀释液 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体12 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
粉剂一 | 粉剂3 g×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前一支试剂二加入65μL蒸馏水溶解，2-8℃可保存4周。
2. 试剂二工作液的配制：根据样本量按照试剂二：试剂二稀释液=10μL：300μL（共310μL，约3S）的比例配制，现配现用。
3. 标准品：10μmol/mL组胺标准液。
4. 0.1875μmol/mL标准品配制：取75μL10μmol/mL组胺标准液，加入925mL蒸馏水，混匀配制成0.75μmol/mL的组胺标准品；再吸取250μL 0.75μmol/mL组胺和750 μL蒸馏水混合配制成0.1875μmol/mL的组胺标准溶液备用。
产品说明：
组胺（Histamine）是一种有潜在危害的含氮低分子量有机化合物，是由组*在脱羧酶的作用下产生的。当组织受到损伤或发生炎症和过敏反应时，都可释放组胺。组胺广泛存在于各种食品中，摄入过量的组胺会对人体产生危害。组胺会被组胺脱氢酶（HDH）特异性分解，在1-mPMS作用下，电子转移通过WST显色，在470nm下有最大吸收峰，据此可以计算组胺含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅/恒温培养箱、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积（mL）为1：2.5~5的比例（建议称取约0.2g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后，于60℃水浴30min，冷却至室温后于4℃ 10000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 10000g离心10min后取上清待测。
2. 红酒等（酚类含量高）液体：称取粉剂一0.05g，加入500μL液体样本和500μL提取液一，冰浴匀浆后，于60℃水浴30min，冷却至室温后于4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 10000g离心10min后取上清待测。
注：1、提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。
2、样本提取后尽可能在2小时内测定结束，若样本量过多建议分批次处理。
3、含酚类高的样本，前处理时加入粉剂一约0.05g，与样本一起冰浴匀浆。如红酒，前处理时取500μL液体样本加入500μL提取液一，和粉剂一约0.05g（无需准确称量），之后按照液体样本继续进行冰浴匀浆后等后续处理。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。
2、 试剂一37℃预热15min。
3、 操作表：（在1.5mLEP管中依次加入以下试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 空白管 | 标准管 |
试剂一 | 650 | 750 | 650 | 650 |
试剂二工作液 | 100 | - | 100 | 100 |
试剂三 | 150 | 150 | 150 | 150 |
蒸馏水 | - | - | 100 | - |
样本 | 100 | 100 | - | - |
标准品 | - | - | - | 100 |
充分混匀，37℃避光反应15min，取反应液于1mL玻璃比色皿中，测定470nm处吸光值A，记为A测定、A对照、A空白、A标准，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准管只需测1-2次。 | ||||
三、组胺含量的计算
1. 按照蛋白浓度计算
组胺含量（μmol/mg prot）=ΔA测定×C标准÷ΔA标准×V样本÷（V样本×Cpr）×F
=0.1875×ΔA测定÷ΔA标准×Cpr×F
C标准：标准管浓度，0.1875μmol/mL；V样本：加入的样本体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；F：稀释倍数。
2. 按照样本质量计算
组胺含量（μmol/g 质量）=ΔA测定×C标准÷ΔA标准×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F =0.223×ΔA测定÷ΔA标准÷W×FC标准：标准管浓度，0.1875μmol/mL；W：样本质量，g；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；F：稀释倍数。
3. 按照液体体积计算
组胺含量（μmol/mL）
=ΔA测定×C标准÷ΔA标准×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）] ×F
=0.445×ΔA测定÷ΔA标准×F
C标准：标准管浓度，0.1875μmol/mL；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，0.5mL；V液体：液体样本体积，0.5mL；F：稀释倍数。
注意事项：
1. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。
2. 如果样本测定吸光值小于0.05或接近空白管吸光值，可适当增大样本量，空白管和标准管也需要进行相应调整，注意同步修改计算公式。
3. ΔA测定大于1或者A测定大于1.5时，可用整理水稀释样本进行测定。
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