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北京市所在地
脂质过氧化物（LPO）含量检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC5240
规格：50T/48S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体7mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃保存 |
稀释液 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前取1瓶试剂二加入14mL 蒸馏水，此试剂较难溶，可以 70℃加热并剧烈振荡以促进溶解，或者通过超声处理以促进溶解。每次用前需检查是否有粉剂析出。用不完的试剂可在2-8℃中保存一个月。
2. 标准品：为1000nmol/mL的标准溶液。
产品说明：
脂质过氧化物（lipid hydroperoxide LPO）是不饱和脂肪酸链经自由基或活性氧作用后产生的过氧化物。病理情况下，脂质过氧化反应增强可导致原本低含量的LPO升高。LPO含量升高会对细胞的结构和功能造成损伤，LPO含量与机体免疫系统和衰老密切相关。
LPO在酸性条件下加热产生丙二醛（MDA），MDA与硫代巴*妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成棕红色物质三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二*），其最大吸收波长在 532nm，进行比色后可估测样本中LPO的含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照样本质量（g）：提取液体积（mL）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。
3、培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。
二、测定步骤
1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至532和600nm，用蒸馏水调零。
2、标准溶液的制备：现标准液为1000nmol/mL的MDA标准溶液，将标准液用稀释液稀释至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 nmol/mL备用，具体稀释可参考下表。
序号 | 稀释前浓度（nmol/mL） | 标准液体积（µL） | 稀释液体积（µL） | 稀释后浓度（nmol/mL） |
1 | 1000 | 40 | 960 | 40 |
2 | 40 | 500 | 500 | 20 |
3 | 20 | 500 | 500 | 10 |
4 | 10 | 500 | 500 | 5 |
5 | 5 | 500 | 500 | 2.5 |
6 | 2.5 | 500 | 500 | 1.25 |
7 | 1.25 | 500 | 500 | 0.625 |
8 | 0.625 | 500 | 500 | 0.3125 |
9 | 0.3125 | 500 | 500 | 0.15625 |
备注：实验中每个标准管需400µL标准溶液。
3、在EP管中按下表步骤加样：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本（μL） | 400 | - | - | - |
蒸馏水（μL） | - | 400 | - | - |
标准液（μL） | - | - | 400 | - |
稀释液（μL） | - | - | - | 400 |
试剂一（μL） | 300 | 300 | 300 | 300 |
试剂二（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂三（μL） | 100 | 100 | 100 | 100 |
将混合液在 45℃（植物样本）或100℃（其他样本）水浴60min 后（标准管在两个温度水浴均可），置于冰浴中冷却，8000g，常温，离心 10min。吸取 900μL 上清液于1mL玻璃比色皿中，测定各样本在 532nm和600nm处的吸光度。分别计算 ΔA=（A532测定-A532对照）-（A600测定-A600对照），ΔA标准=（A532标准-A532空白）- (A600标准-A600空白）（标准曲线，空白管和对照管只需做 1-2 次）。
二、LPO含量的计算
1. 根据标准管的浓度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）代入公式计算样本浓度（x，nmol/mL）
2. 按样本蛋白质浓度计算
LPO含量（nmol/mg prot）=x×V样÷（Cpr×V样）= x÷Cpr
3. 按样本质量计算
LPO含量（nmol/g 质量）=x×V样÷（W×V样÷V样总）= x÷W
4. 按细菌/细胞数量计算
LPO含量（nmol/104cell）= x×V样÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））= x÷细胞数量（万个）
5. 按照液体样本体积计算
LPO含量（nmol/mL）= x
V样：加入样本体积，0.4mL，V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
注意事项：
1. 待测液如果有密集小气泡，建议静置20min左右等待气泡消失再测，以免影响测定结果，如果有少量气泡可以通过低速离心或轻磕等方式来消除。
2. 待测液如果尚未澄清，可吸取上清液后再次离心。
3. 为防止水浴60min过程中水分散失，建议使用螺旋管或用封口膜给EP管缠口。
4. 如果用高温助溶试剂二，需要待其冷却至室温后再使用。
5. 如果测定吸光值过低或接近空白，适当延长反应时间或加大样本量后，重新测定。如果吸光值过大或超过检测范围（A532＞1.5或者ΔA＞1.5时），建议将样本适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例：
1. 称取0.1192 g绿萝叶片，按照测定步骤操作，测得计算A532测定= 0.143，A532对照= 0.005，A600测定= 0.023，A600对照 = 0.004，∆A=0.119，将∆A代入标曲公式y =0.0289x + 0.0032，R2=0.9993，计算得x=4.007，按样本质量计算得：
LPO含量（nmol/g 质量）= x÷W = 33.616 nmol/g 质量。
2. 称取0.1209g大鼠心脏，按照测定步骤操作，测得计算A532测定= 0.122，A532对照= 0.008，A600测定=0.051，A600对照= 0.003，∆A=0.066，将∆A代入标曲公式y =0.0838x + 0.0045，R2=0.9989，得出x=0.734，按样本质量计算得：
LPO含量（nmol/g 质量）= x÷W = 6.071 nmol/g 质量。
参考文献：
Hiroshi Ohkawa, Nobuko Ohishi, Kunio Yagi,Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J],Analytical Biochemistry,1979.
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