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脂蛋白酯酶（LPL）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2440
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 试剂一 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 试剂二 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
| 试剂三 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 标准品 | 液体1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
试剂二：临用前取1支加入1.5 mL丙 酮溶解备用，用不完的试剂-20℃保存4周；
标准品：5 μmol/mL对硝基 *酚标准溶液。临用前取30μL 5μmol/mL标准液，加入450μL试剂一充分混匀，配制成0.3125μmol/mL标准液使用，现用现配（实验中每管需要100μL，为减小实验误差，故配制大体积）。
产品说明：
脂蛋白酯酶（Lipoproteinlipase，LPL）是甘油三酯降解的降速酶，可催化甘油三酯水解为脂肪酸和单酸甘油酯，主要在肝脏实质细胞中合成，在脂质代谢和转运中发挥重要作用。
脂蛋白酯酶水解4-硝基 苯棕榈酸酯产生4-硝基*酚，在400nm有特征吸收峰。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、EP管、冰、丙 酮和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
操作表：在1.5mL EP管中进行下列操作：
| 样本名称 | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
| 样本（μL） | 100 | 100 | - | - |
| 标准管（μL） | - | - | 100 | - |
| 蒸馏水（μL） | - | - | - | 100 |
| 试剂一（μL） | 400 | 360 | 400 | 400 |
| 试剂二（μL） | - | 40 | - | - |
| 混匀，45℃水浴10min | - | - | ||
| 试剂三（μL） | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 充分混匀放置2min后，对照管和测定管8000g常温离心10min，取上清、标准管和空白管于1mL玻璃比色皿中测定400nm处吸光值，记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管，ΔA=A测定管- A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。空白管和标准管只需做1-2次。 | ||||
三、LPL活性计算
1、血清（浆）LPL活力计算
单位定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫升血清每分钟水解产生1nmol 4-硝基 *酚为一个酶活力单位。
LPL（U/mL）=ΔA÷（ΔA标准÷C标准）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准
2、组织、细菌或细胞中LPL活力计算
（1）按样本质量计算
单位定义：在45℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟水解产生1nmol 4-硝基*酚为一个酶活力单位。
LPL（U/g 质量）=ΔA÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷W÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准÷W
（2）按样本蛋白浓度计算
单位定义：在45℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol 4-硝基*酚为一个酶活力单位。
LPL（U/mg prot）=ΔA÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷（V提取×Cpr）÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准÷Cpr
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位定义：在45℃，pH7.5条件下，每104个细胞每分钟水解产生1nmol 4-硝*酚为一个酶活力单位。
LPL（U/104 cell）=ΔA÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷N÷T×1000=31.25×ΔA÷ΔA标准÷N
C标准：标准溶液浓度，0.3125μmol/mL；V提取：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol。
注意事项：
测定管加入试剂二后混变浑浊为正常现象。
若A大于1，将粗酶液用试剂一稀释后再进行测定。
实验实例：
取0.1g大鼠肌肉加入1mL试剂一，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A测定管- A对照管=0.697-0.160=0.537，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.545-0.001=0.544，按样本质量计算酶活得：LPL（U/g 质量）= 31.25×ΔA÷ΔA标准÷W=31.25×0.537÷0.544÷0.1=308.48 U/g 质量。
取兔血清稀释2倍后按照测定步骤操作，测得计算ΔA=A测定管- A对照管=0.639-0.096=0.543，ΔA标准=A标准管-A空白管=0.545-0.001=0.544，按血清（浆）体积计算酶活得：LPL（U/mL）= 31.25×ΔA÷ΔA标准×2（稀释倍数）=31.25×0.543÷0.544×2（稀释倍数）=62.39 U/mL。
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