异柠檬酸含量检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5955

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二工作液：临用前先离心，根据样本量按试剂二：蒸馏水=10μL：90μL（共100μL，约5T）的比例配制后使用，现配现用。

2、 试剂三：临用前加入1.3 mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3、 标准品：临用前加入1 mL蒸馏水充分溶解成20μmol/mL异柠檬酸标准品。

4、 工作液：临用前根据样本量按试剂一：试剂二工作液：试剂三=150μL：20μL：10μL（共180μL，约1T）配成工作液后使用，现配现用。

产品说明：

异柠檬酸（Isocitric Acid）是柠檬酸的异构体，在许多水果和蔬菜以及由这些原料制成的食品中发现了大量的异柠檬酸盐。生物能够利用的是D型异柠檬酸，是三羧酸循环中的一个成分。

异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶（ICDH，EC1.1.1.41）的作用下变成a-酮戊二酸，同时NAD（P）还原为NAD（P）H，据此可以计算异柠檬酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。（提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。）

细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5×10⁶个细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。（提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。）

果汁等液体：取500μL液体样本，加1mg粉剂一混匀后沸水浴5min（缠封口膜，防止爆盖），静置至室温后于4℃ 12000g离心10min，取上清待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 工作液37℃预热10min以上。

3、 标准品的稀释：将20μmol/mL异柠檬酸标准品用蒸馏水进行稀释得到12、10、8、4、2、1、0.5μmol/mL标准品备用。

4、 标准品稀释表：

备注：下述实验中每个标准管需20µL标准品（注意不要在此步骤直接检测标准品吸光度）。

5、 样本测定（在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂）

三、异柠檬酸含量计算公式

1. 标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. 异柠檬酸含量计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

异柠檬酸含量（μmol/g prot）=x×V样本÷（Cpr×V样本）×F=x÷Cpr×F

（2）按样本质量计算：

异柠檬酸含量（μmol/g 质量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷W×F

（3）按细菌或细胞数量计算：

    异柠檬酸含量（μmol/10⁶ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）×F=1.1875×x÷N×F

（4）按液体体积计算：

异柠檬酸含量（μmol/mL）=x×F

V样本：加入的样本体积，0.02mL；V上清：提取时上清液体积，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，以百万计；F：稀释倍数。

注意事项：

1.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

2.若样本ΔA<0.005，可适当增大样本量后测定；若样本ΔA>1.0或A测定>1.5，可用蒸馏水稀释上清液后测定，

注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

3.提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定，如需测定蛋白浓度，需另取组织。

实验实例：

1、 取0.1139g苹果加入提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.140-0.089）-（0.060-0.058）=0.049，带入标曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，计算x=1.015，按样本质量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W×F=10.582 μmol/g 质量。

2、 取0.1033g橙子叶加入提取液进行冰浴匀浆，取上清用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（1.445-1.415）-（0.060-0.058）=0.028，带入标曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，计算x=0.696，按样本质量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W×F=16.002 μmol/g 质量。

3、 取500μL橙汁饮料取上清后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.523-0.516）-（0.060-0.058）=0.005，带入标曲y=0.0658x-0.0178，R²=0.9978，计算x=0.347，按样本质量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/mL）=x×F=0.347 μmol/mL。

参考文献：

[1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

[2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP⁺-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

相关系列产品：

BC1060/BC1065  柠檬酸合酶（CS）活性检测试剂盒

BC2150/BC2155  柠檬酸（CA）含量检测试剂盒

BC2030/BC2035  异柠檬酸裂解酶（ICL）活性检测试剂盒

BC5860/BC5865  甲基柠檬酸合酶（MCS）活性检测试剂盒

异柠檬酸含量检测试剂盒 三羧酸 异柠檬酸含量检测试剂盒 三羧酸