α-酮戊二酸（α-KG）含量检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC5420

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前加入3.34mL蒸馏水充分溶解。未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂四：临用前加入0.5mL蒸馏水充分溶解。未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3、 标准品：临用前加入0.856mL蒸馏水充分溶解，配制成80μmol/mL α-酮戊二酸标准溶液，2-8℃可保存4周。

4、 试剂四工作液：临用前根据样本量按试剂四：蒸馏水=0.1mL：0.4mL（共0.5mL，10T）的比例配制，现用现配。

5、 400nmol/mL标准溶液配制：实验前取50μL的80μmol/mL标准溶液，加入950μL蒸馏水充分混合配制成4μmol/mL标准溶液。再取100μL 4μmol/mL标准溶液和900μL蒸馏水混合配制成0.4 μmol/mL（400nmol/mL）标准溶液备用。

产品说明：

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点。α-酮戊二酸作为一种短链羧酸分子，是谷*酰胺、谷*酸等多种重要的氨基酸的前体，不仅直接参与供能，还参与细胞内多种化学反应，具有多种生理作用。

GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷*酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通过测定NADH的变化，计算α-酮戊二酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/金属浴/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积（mL）为5~1：1的比例（建议5百万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

3. 液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。

2、 加样表：（在1mL比色皿中加入下列试剂）

三、α-酮戊二酸（α-KG）含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

α-KG含量(nmol/mg prot) = C_标准× (ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)×V_样÷ (Cpr×V_样)×F

= 400×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

α-KG含量(nmol/g 质量) = C_标准×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白) × (V_上清+V_提取液二)÷ (W×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)÷W×F

(3) 按细菌或细胞数目计算

α-KG含量(nmol/10⁶ cell) = C_标准×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷(N×V_上清÷V_提取液一)×F

= 475×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)÷N×F

(4) 按液体体积计算

α-KG含量(nmol/mL) = C_标准×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)×(V_上清+V_提取液二)÷[V_液体×V_上清÷(V_液体+V_提取液一)]×F

= 5225×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)×F

C_标准：α-酮戊二酸标准溶液浓度，400 nmol/mL；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.3mL；V_上清：提取时上清的体积，0.8mL；V_提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V_提取液一：加入提取液一的体积，1mL；V_液体：液体样本体积，0.1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数目，以10⁶计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 如果样本A1_测定＜A1_空白或∆A_测定大于0.8，可以用蒸馏水对样本进行稀释或者缩短第二步37℃反应时间；如果∆A_测定小于0.01，可以加大样本量或者延长第二步37℃反应时间。最终计算时同步修改计算公式。

2. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

3. 温度对该实验影响较大，务必保持反应温度在37℃。

实验实例：

1、 称取0.1066g小鼠肝脏组织进行样本处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA_测定=A1_测定-A2_测定=1.201-1.175=0.026，ΔA_标准=A1_标准-A2_标准=1.015-0.487=0.528，ΔA_空白=A1_空白-A2_空白=1.080-1.074= 0.006。带入公式计算：

α-KG含量（nmol/g 质量）=475×(ΔA_测定-ΔA_空白) ÷ (ΔA_标准-ΔA_空白)÷W×F =170.72 nmol/g 质量

参考文献：

[1] Azmi N E, Ahmad M, Abdullah J, et al. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 388(1):28-32.

[2] Fei Ding, Qiannan Hu, Meiling Wang, et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)

[3] Lin Y, Nan J, Shen J, et al. Canagliflozin impairs blood reperfusion of ischaemic lower limb partially by inhibiting the retention and paracrine function of bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. EBioMedicine, 2020, 52: 102637  

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