甲基柠檬酸合酶（MCS）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5860

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂四：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂五：试剂放于棕色瓶内玻璃瓶中，临用前加入3mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：

甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

MCS 催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅*A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸收峰，据此可以计算MCS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）和10μL试剂一，进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液和10μL试剂一），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后12000 g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、 试剂二置于37℃水浴中预热15min。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分别加入（适用于测定动物组织样本）

4、 操作表：在1mL玻璃比色皿或1.5mL EP管中分别加入（适用于测定微生物和植物组织样本）

注：在1.5mL EP管中进行反应时，可参考以下步骤：先将比色皿置于分光光度计中，然后将反应液混匀后迅速加入1mL玻璃比色皿中，记录412nm下10s时的初始吸光度A1对照、A1测定，之后迅速将反应液吸取到1.5mL EP管中，置于37℃水浴中准确反应30min，迅速取出EP管并擦干，412nm下记录30min10s时的吸光度A2对照、A2测定。

三、甲基柠檬酸合酶（MCS）计算公式

1. 动物组织样本：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V样）÷T=420.17×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V样）÷T=424.37×ΔA÷W

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V反：反应体系体积，1mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.035mL；V提取：加入提取液及试剂一的体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

2. 微生物和植物组织样本：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（Cpr×V样）÷T=12.25×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（W÷V提取×V样）÷T=12.38×ΔA÷W

（3）按细菌/细胞计算：

酶活定义：每10⁶个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反÷（N÷V提取×V样）÷T = 12.38×ΔA÷N

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V反：反应体系体积，1mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.2mL；V提取：加入提取液及试剂一的体积，1.01mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计。

注意事项：

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 由于提取液含有蛋白成分（约1mg/mL），故测定蛋白浓度时需要同时测定提取液的蛋白浓度。

4. 当样本ΔA＜0.01时，可适当延长酶促反应时间或增大样本量后测定，注意同步修改计算公式。

5. 当样本ΔA>1或A>1.5时，可将样本用提取液适当稀释后测定，注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 取0.0918g小鼠心脏加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清用后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.930-0.339）-（0.333-0.294）=0.552，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）= 424.37×ΔA÷W =2551.76U/g 质量。

2、 取0.1186g霉菌加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.536-0.396）-（0.357-0.376）=0.159，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）=12.38×ΔA÷W =16.60 U/g 质量。

3、 取0.1013g竹叶加入1mL提取液和10μL试剂一进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.477-0.413）-（0.411-0.403）=0.056，按样本质量计算MCS活性得：

MCS活性（U/g 质量）=12.38×ΔA÷W =6.844 U/g 质量。

参考文献：

[1] Maerker, C, et al. "Methylcitrate synthase from Aspergillus fumigatus. Propionyl-CoA affects polyketide synthesis, growth and morphology of conidia. " Febs Journal 272.14(2010):3615-3630.

[2] Watson, D., Lindel, D.L. & Fall, R. Pseudomonas aeruginosa contains an inducible methylcitrate synthase. Current Microbiology 8, 17–21 (1983).

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