异柠檬酸含量检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC5950

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二工作液：临用前先离心，根据样本量按试剂二：蒸馏水=10μL：90μL（共100μL，约1T）的比例配制后使用，现配现用。

2、 试剂三：临用前加入4 mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3、 标准品：临用前加入1 mL蒸馏水充分溶解成20μmol/mL异柠檬酸标准品。

4、 工作液：临用前根据样本量按试剂一：试剂二工作液：试剂三=750μL：100μL：50μL（共900μL，约1T）配成工作液后使用，现配现用。

产品说明：

异柠檬酸（Isocitric Acid）是柠檬酸的异构体，在许多水果和蔬菜以及由这些原料制成的食品中发现了大量的异柠檬酸盐。生物能够利用的是D型异柠檬酸，是三羧酸循环中的一个成分。异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶（ICDH，EC1.1.1.41）的作用下变成a-酮戊二酸，同时NAD（P）还原为NAD（P）H，据此可以计算异柠檬酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、1mL石英比色皿、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：具体的操作步骤请见“产品资料”文件

注意事项：

1.最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

2.若样本ΔA<0.005，可适当增大样本量后测定；若样本ΔA>1.2或A测定>1.5，可用蒸馏水稀释上清液后测定，

注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

3.提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定，如需测定蛋白浓度，需另取组织。

实验实例：

1、 取0.1139g苹果加入提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.241-0.125）-（0.066-0.059）=0.109，带入标曲y=0.1414x-0.0466，R²=0.9991，计算x=1.100，按样本质量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W×F=11.468 μmol/g 质量。

2、 取0.1033g橙子叶加入提取液进行冰浴匀浆，取上清用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（1.001-0.923）-（0.066-0.059）=0.071，带入标曲y=0.1414x-0.0466，R²=0.9991，计算x=0.832，按样本质量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/g 质量）=1.1875×x÷W×F=19.129 μmol/g 质量。

3、 取500μL橙汁饮料取上清后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.856-0.840）-（0.066-0.059）=0.009，带入标曲y==0.1414x-0.0466，R²=0.9991，计算x=0.393，按液体体积量计算异柠檬酸含量得：

异柠檬酸含量（μmol/mL）=x×F=0.393 μmol/mL。

参考文献：

[1] Kvasni Ka, Franti Ek, et al. "Determination of Isocitric Acid in Citrus Juice—A Comparison of HPLC, Enzyme Set and Capillary Isotachophoresis Methods." Journal of Food Composition & Analysis 15.6(2002):685-691.

[2] Kong, Min Jung, et al. "Mitochondrial NADP⁺-dependent isocitrate dehydrogenase deficiency increases cisplatin-induced oxidative damage in the kidney tubule cells." Cell Death & Disease 9.5(2018):488.

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