Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
Protein A/G Agarose Beads 蛋白A/G琼脂糖珠
面议Bovine Serum Albumin(BSA), DNase, Protease, IgG Fr
面议Timentin(特美//汀)
面议Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red 胰酶-EDTA溶液(0.25%),
面议Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse IgM , µ
面议Bovine Serum Albumin(BSA), Fatty Acid Free 牛
面议GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂
面议琼脂糖树脂(GST标签蛋白纯化)
¥698His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂
面议独脚金内酯
¥593GAPDH (Clone:1A6), Mouse mAb 小鼠抗GAPDH 单克隆抗体
面议Calcein-AM/PI Double Stain Kit
面议产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒 | 10186ES50 | 50 T | 323.00 |
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR试剂盒 | 10186ES70 | 200 T | 983.00 |
产品描述
全血直接PCR试剂盒是一款可以直接对全血样本进行PCR扩增的试剂盒,无需DNA提取或样品处理,大大降低了污染风险,缩短了检测时间。
试剂盒中包含配方优化的2× Blood Master Mix,具有很强抑制物耐受性,人血的模板大加入量可达45%,鼠血的可达20%,可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA篇段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,扩增产物末端加A,适用于Hieff Clone®快速克隆试剂盒(货号:10907ES60/10908ES60)。
该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括:新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干xue渍,且兼容所有常规抗凝剂(EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。适用样本来源包括人血、鼠血、鸡血、鸟血、牛血、狗血等。
产品组分
编号 | 组分 | 产品编号/规格 | |
10186ES50(50T) | 10186ES70(200T) | ||
10186-A | 2× Blood Master Mixa | 500 µL | 1 mL× 2 |
a)2× Blood Master Mix:包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等,产品已混合溴酚蓝染料(不含SDS),PCR产物可以直接进行电泳。
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存。避免反复冻融。
操作方法
1. PCR反应体系配制
组分 | 体积(μL) | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Blood Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
抗凝全血 | X | X | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】:使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
a)模板使用量:进行基因组上的目的片段检测,建议使用少量的血液量作为模板;检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段,建议扩大PCR体系并使用较大量的血液模板。血液模板多占PCR体系的45%(人血)、20%(鼠血)。若模板使用含有血液的采集卡,可截取直径1-4 mm的血点,直接加入20-50 μL PCR反应体系进行扩增。
b)引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-0.5 μM之间进行调整。
c)反应体系:推荐使用20 μL或 50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
d)体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。
2. PCR反应条件设置
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 5 min | 1 |
变性 | 95℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50℃~65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
终延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】: a)预变性:95℃,5 min可以让白细胞裂解,释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。
b)退火温度:退火温度设置为引物Tm值即可。然而,使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增,并提高全血模板的扩增效率。因此,如扩增产物特异性较差,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板适退火温度。
c)延伸时间:按30 sec/kb设定,如不足30 sec,设置30 sec即可。
d)扩增循环数:35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。
3. 扩增产物分析
PCR完成后,建议将反应液于1000× g (大约4000 rpm) 离心1~3 min以沉淀血细胞碎片,之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要,因为经过PCR循环,反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测,如琼脂糖电泳检测。注意:由于血液本身的原因,PCR 结束后在 PCR 管的底部会出现透明凝胶状物质,此为正常现象。
4. 对照反应
在PCR结果分析时,不管是阳性结果或阴性结果,如果没有对照反应,都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析,建议在进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
4.1 阳性对照反应体系
组分 | 体积(μL) | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Blood Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
模板DNA | X | X | 100-200 ng |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】:a)模板DNA:选用样本纯化的DNA。
b)引物的选择:建议选择该样本较易扩增的基因的引物,如 β-actin 基因或 GAPDH 等。
4.2 阴性对照
PCR反应体系被污染会导致PCR结果出现假阳性,需要设置阴性对照来排除。将使用的移液器枪头浸泡在2× Blood Master Mix中,添加引物,ddH2O进行PCR扩增;另取ddH2O作为模板,用目的基因引物进行PCR扩增,以排除PCR体系是否被污染和实验是否有其他污染源。
注意事项
1. 尽量使用新鲜抗凝血。若冻存血,应避免反复冻融。
2. 解冻后2× Blood Master Mix可能出现浑浊,冰上放置1-2 min,待溶液澄清后,上下颠倒混匀,不影响试剂性能。
3. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率*。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
常见问题与解决方法
常见问题 | 可能原因 | 解决方法 |
阳性对照、待测样本均无条带。 | PCR反应体系或反应条件不合适。 | 使用梯度PCR摸索PCR *反应条件。 |
PCR试剂保存不当失去活性。 | 2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。 | |
引物设计问题。 | 尝试重新设计引物进行检查。 | |
阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。 | 血液样本保存不当,基因组DNA降解。 | 抗凝全血可在4℃保存2-8天,需长时间保存可将样本置于在-20℃或-70℃冻存,并避免反复冻融。 |
模板加入量不适合。 | 可在PCR体系10%-30%范围内优化血液加入量;若是扩增血液样本中的病毒或细菌DNA篇段,可将模板量增加至30%-40%。 | |
PCR循环数不足。 | 适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。 | |
非特异性扩增 | PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。 | 增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。 |
PCR引物错配。 | 重新设计PCR引物。 | |
配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。 | PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。 | |
阴性对照出现目的条带 | 操作工具或试剂污染。 | 实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 |
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HB190220