Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit是利用新一代拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，搭配高效的平末端化因子，兼容平末端产物及粘性末端产物的快速克隆。与传统的连接酶相比，具有以下优势：1) 快速，仅需5分钟即可完成连接反应。2) 高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3) 可连接长达5 kb目的产物。

组分信息

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

1. 反应体系

*PCR 产物不能磷酸化。如扩增模板为质粒，模板质粒会在后续实验中引起假阳性，因此推荐PCR产物进行胶回收后连接。0.1-1 kb片段投入量推荐20-50 ng，1-2 kb片段投入量推荐50-100 ng，2-4 kb片段投入量推荐100-200 ng，4-5 kb片段投入量推荐200-300 ng。

2. 反应条件

混匀上述体系，于室温(20-37℃)反应5 min。连接反应不可于冰上进行。室温(20-37℃)下孵育时，建议孵育时间不超过5 min，如果PCR产物浓度较低或者片段较长，则可以适当延长孵育时间，不宜超过15 min（推荐使用25℃，PCR仪控温）。

3. 转化

1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802ES）。

2）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置25 min。

3）42℃热激60 sec，冰上孵育2 min。

4）加入500 μL SOC或LB培养基，37℃，200 rpm，摇菌60 min。

5）5000 rpm离心4 min，弃上清至100 μL，用剩余培养基重悬菌体。用无菌涂布棒将菌液均匀涂抹在含有正确抗性的平板上。待菌液被培养基吸收后，倒置平板，于37℃过夜培养。

4. 克隆鉴定

可选择测序法或酶切法进行鉴定。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至菌落PCR Mix中混匀（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接进行PCR反应。测序引物：

M13F ：GTAAAACGACGGCCAGT

M13R ：CAGGAAACAGCTATGAC

载体信息

注意事项

1. 需自备的材料：

1）自备试剂（仅罗列部分）：

1. 超级感受态：转化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超级感受态细胞（Cat#11802ES）。

2. 高保真酶：2× Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10154ES）或其他等效产品。

3. 菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效产品。

4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效产品。

2）自备仪器耗材（仅罗列部分）：PCR仪，水平电泳槽，切胶仪，EP管等。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！