中检维康iELisaT-2毒素检测试剂盒
- 概要
T2毒素(T2)是由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品,对人类健康及畜牧业构成了较大危害。T-2毒素主要影响血液,肝脏,肾脏,胰腺肌肉及淋巴细胞的功能,T-2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。使用T2毒素试剂盒则能够快速而准确的分析样品中T2毒素残留。
- 原理
测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有偶联抗原。分别加入T2毒素标准品或样品、酶标记物和抗体于微孔中,样品/标准品竞争结合抗体,酶标记物可与一抗结合,再于酶标版上的包被抗原结合。反应洗涤后,加入TMB底物显蓝色,加入终止液后颜色由蓝变黄,用酶标仪在450nm处检测,吸光值与样品中T2毒素含量成负相关,与标准曲线比较即可得出T2毒素的含量。
- 试剂盒的组成
- 包被有抗原的96微孔板:1块(96 孔,12条×8 孔)
- T2毒素标准品:0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL 1 瓶 × 1.0mL
- T2抗体 1瓶 ×10mL
- 酶标记物 1 瓶 ×10mL
- 10× 浓缩洗涤液: 1瓶 × 50mL
- T2稀释缓冲液A: 1瓶 × 50mL
- T2稀释缓冲液B: 1瓶 × 50mL
- 显色底物TMB: 1瓶 × 17mL
- 终止液: 1瓶 × 7mL
- 试剂盒说明书: 1份
- 质检报告: 1份
- 需要的仪器、试剂
1)仪器
- 酶标仪450nm(iELisa全自动酶标仪或相当者)
- 微量移液器:20μL-200μL单道,100μL-1000μL单道, 50μL-300μL八道
- 多功能旋转混合器(或者摇床、高速均质器)
- 酶标板振荡器
- 涡旋混合器
- 50mL离心管
- 1.5mL离心管
- 定性滤纸
- 过滤漏斗
- —天平:感量0.01g
- 试剂
- 样品提取液70%甲醇:取700mL甲醇,加300mL纯水,混匀。
- 样品处理
5.1谷物(玉米、小麦、高粱、大米、大豆):
- 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中,加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡30分钟(或使用高速均质器均质3分钟,或摇床上振荡40分钟)。
- 将提取液用普通滤纸过滤,吸取100μL滤液置于1.5mL离心管中,加入900μL T2稀释缓冲液A,用涡旋混合器混匀。
稀释倍数:50
5.2饲料:
- 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中,加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡30分钟(或使用高速均质器均质3分钟,或摇床上振荡40分钟)。
- 将提取液用普通滤纸过滤,用0.22μm有机系滤膜过滤后,取100μL滤液置于1.5mL离心管中,加入900uL T2稀释缓冲液B,用涡旋混合器混匀。
稀释倍数:50
6. 酶联免疫分析程序
6.1测定之前注意事项
- 使用前将所有试剂平衡至室温(20-25℃)。
- 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
- 所有温育过程应避免阳光直射,并按要求用盖板覆盖住酶标板。
6.2溶液的配制
- 提取液的配制: 根据实验所需的量配制70%的甲醇水溶液(水要用纯水、或蒸馏水、去离子水)
- 洗涤液的配制:将浓缩洗涤液用纯水稀释10倍后使用。(例如:取10 mL 浓缩液+90 mL纯水, 可以用于32孔的检测)。
6.3测定程序
- 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架,标准品和样品做两个平行实验,记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
- 分别吸取50μL标准品和样品加至相应的微孔(双孔)中,然后再各加入50μL的酶标记物,后加入50μL的T2抗体,装入袋中密封,室温(25℃)温育20分钟。
- 倒出孔中的液体,每孔加入250μL稀释好的洗涤液洗涤,重复操作四次。洗板时每次间隔30s,洗完后用力在吸水纸上排干。
- 每孔加入100μL显色底物,避光室温(25℃)温育10分钟。
- 每孔加入50μL终止液,混匀。
- 置于酶标仪中,振荡混匀,在450nm处测定吸光度值(OD值),参比波长630nm。(iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值)。
7. 结果判定
1)所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以DI个标准(0标准)的吸光度值(B<苏b>0苏b>)再乘以100%,即百分吸光度值。
百分吸光度值(%)= | B | ×100% |
B<苏b>0苏b> |
以T2毒素标准品浓度值(ppb)为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法,计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件,更便于大量样品的快速分析。
- 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。
- 如果测定值超出检测范围,样品提取溶液按一定的比例用70%甲醇进行稀释。
8. 注意事项
- 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温(20- 25℃)会导致数值偏低。
- 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
- 标准物质和显色液对光敏感,避免直接暴露在光线下。
- 混合要均匀,洗板要*(包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀)。
- 终止液为强酸性物质,避免接触皮肤。
- 不要使用过了有效期的试剂盒,也不要混合使用不同批次的试剂盒,这样会引起测定结果不准确。
- 试剂盒的储存条件是2-8℃,切勿冷冻。
9. 中检维康iELisaT-2毒素检测试剂盒的性能指标
- 检测限LOD: 谷物10ppb(μg/kg),饲料15ppb,(LOD:空白样品测定值+2倍标准偏差SD)
- 定量限LOQ: 谷物25ppb,饲料30ppb。
- 定量检测范围:谷物25-1000ppb,饲料30-1000ppb。