中检维康iELisa伏马毒素B1检测试剂盒

1. 概要

伏马毒素是串珠镰刀菌、轮状镰刀菌和多育镰刀菌等产生的。伏马毒素B1和B2是自然界存在普遍且毒性qiang的两种毒素。其主要存在于玉米及玉米制品中，在大米、面条、调味品、高粱以及啤酒中也有较低浓度的伏马毒素存在。1993年伏马毒素被癌症研究机构（IARC）归类为2B类致癌物。

1. 原理

测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有抗抗体。加入伏马毒素标准品或样品、酶标抗原和抗体后，游离的伏马毒素与酶标抗原竞争结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔板上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗原及抗体被洗去，加入TMB底物显蓝色，加入终止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在450nm处检测，吸光值与样品中伏马毒素含量成负相关，与标准曲线比较即可得出伏马毒素的含量。

1. 试剂盒的组成

1. 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12条×8 孔）
2. 伏马毒素B1标准品：0 ng/mL、1 ng/mL、 4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL                1瓶 × 1.0mL
3. Fum酶标抗原：              1瓶 ×10mL
4. Fum抗体：                  1瓶 ×10mL
5. 10× 浓缩洗涤液：           1瓶 × 50mL
6. Fum稀释缓冲液A：          1瓶 × 50mL
7. Fum稀释缓冲液B：          1瓶 × 50mL
8. 显色底物TMB：             1瓶 × 17mL
9. 终止液：                    1瓶 × 7mL
10. 试剂盒说明书：               1份
11. 质检报告：                   1份

1. 需要的仪器、试剂

1）仪器   

1. 酶标仪450nm（iELisa全自动酶标仪或相当者）
2. 微量移液器：20μL-200μL单道，100μL-1000μL单道, 50μL-300μL八道
3. 多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器）
4. 酶标板振荡器
5. 涡旋混合器
6. 50mL离心管
7. 1.5mL离心管
8. 定性滤纸
9. 过滤漏斗
10. 天平：感量0.01g

1. 试剂

1. 样品提取液70%甲醇：取700mL甲醇，加300mL纯水，混匀。

1. 样品处理

5.1谷物（玉米、小麦、高粱、大米、大豆）：

1. 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡10分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟）。
2. 将提取液用普通滤纸过滤，吸取50μL滤液置于1.5mL离心管中，加入450μL Fum稀释缓冲液A，用涡旋混合器混匀。

稀释倍数：50

5.2饲料：

1. 称取5.0g粉碎样品于50mL离心管中，加入25.0mL样品提取液70%甲醇,置于多功能旋转混合器上振荡10分钟（或使用高速均质器均质3分钟，或摇床上振荡40分钟）。
2. 将提取液用普通滤纸过滤，(复杂基质样品建议用0.22μm有机系滤膜过滤后使用)，取20μL滤液置于1.5mL离心管中，加入780uL Fum稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。

稀释倍数：200

5.3啤酒：

取5mL啤酒超声5分钟，取100μL超声后啤酒样品于1mL离心管中，加入900μL Fum稀释缓冲液B，用涡旋混合器混匀。

稀释倍数：10

6． 酶联免疫分析程序

6.1测定之前注意事项

1. 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。
2. 使用后迅速将试剂放入2-8℃冷藏。
3. 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4. 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖板覆盖住酶标板。

6.2溶液的配制

1. 提取液的配制: 根据实验所需的量配制70%的甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子水）
2. 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释10倍后使用。（例如：取10 mL 浓缩液+90 mL纯水, 可以用于32孔的检测）。

6.3测定程序

1. 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔袋封好置2-8℃冷藏保存。
2. 吸取50μL 标准品或样品分别加至相应的微孔（双孔）中，然后各加入50μL Fum酶标抗原，再加入50μL Fum抗体，加盖，在室温温育30分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。
3. 倒出孔中的液体，每孔加入250μL 稀释好的洗涤液，置于酶标板振荡器上振荡30秒（或者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在吸水纸上拍干。
4. 每孔加入150μL显色底物TMB，室温避光温育10分钟。
5. 每孔加入50μL 终止液。
6. 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸光度值（OD值），参比波长630nm。（iELisa全自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。

7.  结果判定

1）所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以DI一个标准（0标准）的吸光度值（B<苏b>0）再乘以100%，即百分吸光度值。

以伏马毒素B1标准品浓度值（ppb）为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

1. 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍数。
2. 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一定的比例用70%甲醇进行稀释。

8.  注意事项

1. 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。
2. 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
3. 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在光线下。
4. 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5. 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6. 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不准确。
7. 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。

9.  中检维康iELisa伏马毒素B1检测试剂盒的性能指标

1. 检测限LOD: 谷物30ppb(μg/kg)，饲料120ppb，

啤酒6ppb（LOD：空白样品测定值+2倍标准偏差SD）

1. 定量限LOQ: 谷物50ppb，饲料200ppb，啤酒10ppb。
2. 定量检测范围：谷物50-2500ppb，饲料200-10000ppb，啤酒10-500ppb。