一氧化氮合成酶（NOS）检测试剂盒  BB-4702-50T

一氧化氮合成酶（NOS）检测试剂盒

使用方法：

一、试剂配制

   1. 试剂A： 底物缓冲液 6ml×2 瓶，－20℃以下避光冷冻保存 3 个月。临用前化冻摇匀。没有用完的试剂，可以－20℃以下避光冷冻保存以备下次再用。

2. 试剂 B 工作液：促进剂淡黄色或白色粉剂×3 支，溶解液600ul×3 瓶。-20℃以下冷冻保存 6 个月。使用前取试剂 B 溶解液一瓶600ul加入一支粉剂中充分混匀（即将 1.5ml 小离心管反复颠倒，并将小离心管尖部的液体离心下来），测试后剩余的试剂可放入－20℃以下冷冻保存，时间不超过一周。若发现粉剂变成黄褐色或咖啡色，则不可再用。

3. 试剂C：黄色显色剂 6ml×1 瓶，4℃避光冷藏保存 3 个月。

4. 试剂D：透明剂 6ml×1 瓶，室温保存 6 个月。天冷后会凝固，待 37℃水浴变澄清时再使用。

5. 试剂E：终止剂 60ml×2 瓶，4℃保存 6 个月。室温低时会出现浑浊，待 37℃水浴加热至透明后再用。

二、  操作步骤：

使用注意事项：

• 样本及试剂从冰箱取出，37℃水浴至溶解*，试剂D 和试剂E 必须澄清透明，再进行操作，否则会影响结果。
• 试剂A 与配制好的试剂 B 工作液应尽量避免反复冻融。
• 试剂 B 工作液现用现配，配好后尽量一日内用完，如有剩余则－20℃以下保存不超过一周；未配制之前的试剂 B 和溶解液均应－20℃以下保存，如淡黄色或白色粉末变成咖啡色或黄褐色颗粒则失效不可用。
• NOS 活性低，稳定性差，样品或匀浆上清如不马上检测，应置-20℃以下冷冻保存。
• 室温低时，NOS 试剂E 会出现浑浊，如果已经在测试管中加入了 NOS 试剂 E，可将测试管对着灯光，观察有无结晶或浑浊。如果有结晶或浑浊，请将每只测试管放到 37℃水浴锅中晃动 5 分钟，再比色。
• 所有实验用水均需使用纯水或双蒸水。
• 需使用一次性塑料试管，若没有，使用较新的玻璃管并*洗刷干净。

1. 操作表：

        混匀，蒸馏水调零，530nm，1cm光径，测各管吸光度值。

注意：  1、室温较低时，所有的试剂均应置于37℃预热5分钟。

                         2、取上清时，如果上清量不够，请延长离心时间，或者少取一点。例如：可取0.4或0.45ml，但您同一批实验所有的管子都应取上清的量要*，千万不可将沉淀吸上。

1. NOS酶活力计算：

(一)、血清中NOS酶活力计算：

（1）单位定义：每毫升血清每分钟生成 1nmol NO 为一个酶活力单位。

  （2）计算公式：

总NOS活力（U/mL）=  总NOS测定管OD值—空白管OD值 x反应液总体积  x        1           ÷1000                         

呈色物纳摩尔消光系数             取样量      比色光径x反应时间

                    =总NOS测定管OD值—空白管OD值 x   2.41+X  x        1           ÷1000                         

38.3x10^-6                          X            1x15

    （3）计算举例：

    取血清30ul按操作表进行检测，测得空白管吸光度为0.021，总NOS测定管吸光度为0.287，则计算结果为：

总NOS活力（U/mL）=  总NOS测定管OD值—空白管OD值 x反应液总体积  x        1           ÷1000                         

呈色物纳摩尔消光系数             取样量      比色光径x反应时间

                    =     0.287—0.021  x   2.41+0.03   x      1     ÷1000 =37.658 U/mL                        

38.3x10^-6          0.03           1x15

(二)、组织NOS酶活力计算：

（1）单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成 1nmol NO 为一个酶活力单位。

     （2）计算公式

总NOS活力（U/mgprot）=  总NOS测定管OD值—空白管OD值 x反应液总体积  x        1           ÷

                                 呈色物纳摩尔消光系数            取样量       比色光径x反应时间

待测样本蛋白浓度（mgprot/L）                       

                    =总NOS测定管OD值—空白管OD值 x 2.41+ X  x    1   ÷待测样本蛋白浓度（mgprot/L）                         

38.3x10^-6                        X        1x15

（3）计算举例：

    取大鼠肝组织0.15g加9倍的生理盐水1.35ml制备成10%的组织匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清50ul测NOS活力，取50ul测蛋白含量。测得空白管吸光度为0.019，总NOS测定管吸光度为0.202，同时测得蛋白含量为12.5mgprot/ml，则计算结果为：

总NOS活力（U/mgprot）=  总NOS测定管OD值—空白管OD值 x反应液总体积  x        1           ÷

                                 呈色物纳摩尔消光系数            取样量       比色光径x反应时间

待测样本蛋白浓度（mgprot/L）                       

                    = 0.202—0.019  x 2.41+0.05  x    1    ÷（12.5x10³）（mgprot/L）=1.254 U/mgprot                      

38.3x10^-6        0.05         1x15

参考取样量：

1. 血清30ul。
2. 10%组织匀浆一般取50-100ul；
3. 细胞悬液一般取500ul，细胞培养液一般取100ul。

参考值：

一氧化氮合成酶（NOS）检测试剂盒

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