线粒体膜通透性转换孔（MPTP）检测试剂盒    BB-48122-1

线粒体膜通透性转换孔（MPTP）检测试剂盒

使用方法：

使用注意事项：

• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
• 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
• 染色后立即进行分析。
• 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先确定*条件。以下方法仅供参考。
• BBcellProbe^TM CA1探针容易受潮，稳定性较差，注意干燥保存。
• 吸取BBcellProbe^TM CA1探针母液时要用干燥的新吸头，不能使用含水的吸头。
• 未使用完的BBcellProbe^TM CA1探针母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
• BBcellProbe^TM CA1探针工作液含水，配制后不可以*保存，须现配现用。
• Ca²⁺通透剂配制工作液后可以保存。
• CA1探针和Ca²⁺通透剂融解后离心至管底部再打开螺旋盖，防止开盖时损失。

1. 试剂配制：
   1. BBcellProbe^TM CA1染色工作液配制：根据样品数量用MPTP染色buffer稀释 BBcellProbe^TM CA1探针10倍，配制成BBcellProbe^TM CA1染色工作液，充分混匀。
   2. Ca²⁺通透剂工作液配制：根据样品数量用MPTP染色buffer 10倍稀释 Ca²⁺通透剂（10X），配制成1X Ca²⁺通透剂工作液，充分混匀。

1. 细胞染色

2.1用MPTP染色buffer将样品细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×10⁶细胞/ml以上。

【注】：① 也可以用其他缓冲液如HBSS等制备单细胞悬液，但是用于加Ca²⁺通透剂的对照样品的缓冲液必须含有Ca²⁺；

           ② BBcellProbe^TM CA1探针加载时不能含有血清；

           ③ 细胞必须为单细胞悬液。

2.2 按照500ul每管将细胞悬液等分，每个样品等分成3份，并记录编号。

【注】：后续染色顺序：

1号管仅含BBcellProbe^TM CA1探针，

2号管含BBcellProbe^TM CA1探针和淬灭剂，

3号管含BBcellProbe^TM CA1探针，淬灭剂和通透剂，

另外准备一管不加以上试剂的细胞样品（4号管）用于流式仪器设置。

2.3 向上述每个样品的三管细胞中分别加入5µl BBcellProbe^TM CA1探针工作液并混匀。

【注】：*该探针加载浓度在100-300倍稀释，具体的使用浓度需根据不同细胞的实验要求进行优化。

2.4 向2号、3号管中加入5ul淬灭剂，并混匀。

【注】：淬灭剂加入2-5µl即可，具体的使用浓度需根据不同细胞的实验要求进行优化。

2.5 向3号管中加入5µl-10ul  Ca²⁺通透剂，并混匀。

2.6 在37℃避光孵育15分钟。

2.7 离心力1000g以下离心5分钟收集细胞。

【注】：此步可去除多余染料以及可能引起荧光淬灭的试剂。

2.8 用500µl MPTP染色buffer重悬细胞。

【注】：如果需要，也可进行进一步染色。如用标记的Annexin V 检测磷酯酰丝氨酸易位(BB-4101 Anneexin V细胞凋亡检测试剂盒)；用PI 检测细胞活力；或者用BBcellProbe^TM M11探针检测线粒体活力等。注意整个过程均需避光操作。

2.9 染色后，将样品置于冰上，1小时内进行流式分析。

3、细胞检测

用不含试剂的细胞样品（4号管）进行流式仪器设置。用流式488nm激发器进行荧光分析，BBcellProbe^TM CA1探针zui大激发波长495nm，zui大发射波长515nm。

1号管-仅含BBcellProbe^TM CA1探针：线粒体和胞浆有荧光，荧光信号较强；

2号管-含BBcellProbe^TM CA1探针和淬灭剂：仅线粒体呈现荧光，荧光强度居中；

3号管-含BBcellProbe^TM CA1探针，淬灭剂和通透剂：线粒体和胞浆荧光均被淬灭，荧光信号zui弱。

2号管和3号管荧光信号的变化说明线粒体通透性转换孔被激活。

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