多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0190
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。

产品简介：
PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
PPO能够催化邻苯二酚产生邻苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2. 称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）：直接检测。若有浑浊请离心后去上清使用。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）

37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。冷却后，5000g，常温离心10min，收集上清，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。
注意：每个测定管需要设置一个对照管，可以在不同对照管中加入不同样本的粗酶液，然后集中进行5min沸水浴处理。
三、PPO活性计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO活性（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V反总÷（Cpr×V样）÷T =60×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO活性（U/g 质量）=ΔA÷0.01×V反总÷（W÷V样总×V样）÷T =60×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞数量计算：
单位的定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位。
PPO活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷0.01×V反总÷（500÷V样总×V样）÷T =0.12×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.9mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.15mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞数量，500万；T：反应时间，10min。
注意事项：
不同样本的多酚氧化酶最佳的反应温度略有差别，可在25-37℃之间进行调节。
相关发表文献：

1. Li B, Ding Y, Tang X, et al. Effect of L-Arginine on Maintaining Storage Quality of the White Button Mushroom (Agaricus bisporus)[J]. Food and Bioprocess Technology, 2019, 12(4): 563-574.

2. B Li,Y Ding, X Tang,et al. MTA1 promotes the invasion and migration of pancreatic cancer cells potentially through the HIF-α/VEGF pathway. Journal of Receptor and Signal Transduction Research. August 2018;(IF2.998)

参考文献：

1. González, Eva M, De Ancos B , Cano M P . Partial Characterization of Polyphenol Oxidase Activity in Raspberry Fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(10):4068-4072.

2. Hong‐Wei Zhou, Feng X . Polyphenol oxidase from yali pear (Pyrus bretschneideri)[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1991, 57(3):307-313.

3. Tang W, Newton R J . Increase of polyphenol oxidase and decrease of polyamines correlate with tissue browning in Virginia pine (Pinus virginiana Mill.)[J]. plant science, 2004, 167(3):621-628.

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