柠檬酸合酶（CS）活
性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号: BC1060
规格: 25T/12S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂五：临用前加入500 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2. 试剂六：临用前加入1.5 mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅*A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液和10μL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆液600g，4℃离心5min。将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS。

4. 在沉淀中加入200μL试剂一和2μL 试剂二，反复吹打充分混匀，用于CS测定，并用于蛋白浓度测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中预热10min左右（保证无沉淀）。

3. 操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入

将上述试剂按顺序加入1mL玻璃比色皿中，加试剂六的同时开始计时，记录412nm波长下10秒时的初始吸光度A1，之后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，412nm下记录2分10秒时的吸光度A2，并计算测定管的ΔA1=A2-A1，对照管的ΔA1’=A2’-A1’，ΔA=ΔA1-ΔA1’。
三、CS活性计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义：37℃或25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷（Cpr×V样本）÷T=1050×ΔA÷Cpr
ε：TNB的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，1mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.035mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本的蛋白浓度，mg/mL。
注意事项：
1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5、附：使用样本鲜重计算公式
单位的定义：37℃或25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS上清（U/g 质量）=ΔA上清÷ε÷d×V反总÷（W×V样本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 质量）=ΔA沉淀÷ε÷d×V反总÷（W×V样本÷V样总）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 质量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清测定值；ΔA沉淀：沉淀测定值；ε：TNB的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，1mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.035mL；V提取：提取液体积，1.01mL；V样总：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g。
实验实例：
取0.1g小鼠心脏样本加入1mL提取液和10μL试剂二进行匀浆研磨，取上清后再离心，取上清，取沉淀后加入200μL试剂一和2μL试剂二，之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测吸光度后计算上清中：ΔA1= A2-A1=1.213-0.7=0.513，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.513；沉淀中：ΔA 1=A2-A1=0.447-0.133=0.314，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.314，按样本质量计算酶活得：
CS（U/g 质量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
= 1061×0.513÷0.1+212×0.314÷0.1=6108.7U/g 质量。
相关发表文献：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

参考文献：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
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